中关村华康基因研究院----DNA甲基化测序问题集锦
DNA测序常见问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
DNA测序技术的使用中常见问题
DNA测序技术的使用中常见问题DNA测序技术是一项重要的科学工具，被广泛应用于生物医学研究、进化学、司法科学等领域。
然而，在使用DNA测序技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将介绍DNA测序技术使用中常见的问题，并提供相应的解决方案。
1. 样品质量问题在DNA测序之前，样品质量是至关重要的。
低质量的样品会导致测序结果的偏差和错误。
常见的样品质量问题包括样品的纯度不高、浓度不足或者样品受到了污染。
解决方案：- 提高样品纯化方法：使用恰当的纯化试剂和技术来提高样品的纯度，例如使用芳香族化合物或异维酮类物质。
- 检测样品浓度：使用光谱法或者比色法来测量样品中DNA的浓度，确保其符合测序要求。
- 避免样品污染：在样品处理过程中，严格遵守无菌操作规程，使用经过无菌过滤器过滤的试剂和器具。
2. 序列读取长度问题DNA测序技术可以产生从数十个碱基对到上百万个碱基对的序列。
然而，部分DNA测序技术的读取长度有限，这可能影响到某些研究或应用的结果。
解决方案：- 选择合适的测序方法：不同的测序方法具有不同的读取长度，选择适合自己研究目的的测序方法，以满足相关的研究需求。
- 使用测序技术的新发展：不断发展的测序技术，如第三代测序技术，具有较长的读取长度和更高的准确性，可以解决传统测序方法的限制。
3. 突变检测问题DNA测序技术不仅可以用于确定特定序列的顺序，还可以用于检测和鉴定突变。
然而，突变的检测可能受到多种因素的影响，如检测方法的灵敏度和特异性、突变类型的多样性等。
解决方案：- 选择合适的突变检测方法：不同的突变具有不同的检测方法，如SNP分析、插入和缺失突变的分析等。
选择合适的方法来检测特定类型的突变。
- 结合多种检测方法：结合使用不同的突变检测方法可以提高突变检测的准确性和可靠性。
- 验证突变结果：通过使用其他独立的测序技术或方法来验证突变结果，以确保结果的可靠性。
4. 数据分析问题DNA测序技术生成的数据量巨大，数据分析是一个复杂而耗时的过程。
引物测序直播问题及回答
1、我想问下：为什么引物不能退火之后跑胶验证纯度呢？两条引物退火成功率达不到百分之百，里面会存在单链引物，引物退火后跑胶有杂链很正常，不能以此来判断单链引物纯度。
2、老师您好，我想自己设计测序引物，请问对于测序引物有什么要求吗？在待测目的基因前面100bp左右设计引物，GC含量不能太高或太低，3’端不能有错配，引物的长度建议是18-20bp以内。
3、甲基化的建议反向测序,是什么意思?正向测序有甲基化的结构，会导致测序峰图双峰或者严重的时候导致信号突然中断，就可以反向测序，然后正反双向测序结果拼接起来就可以得到完整的序列。
4、老师请问一个测序反应有效的大概有多长?普通序列一个测序反应有效长度大概是800bp左右。
5、请问RNA最长能合多少呢30bp以内。
6、稀释后引物保存时间多久？稀释后的引物一般4℃保存3个月内是没有问题的7、你们的积分的兑换时间有限制吗？积分不清零的8、测序为什么前70bp不准呢一代测序，由于仪器的缺陷，所以前面会有几十bp是不准确的，严重的时候会有70bp左右不准确。
9、老师请问那引物最长能合多长呢？引物最长能合139bp。
10、金开瑞引物合成与外面其他公司引物合成相比，优势有哪些？我们公司技术服务内容比较多，内部和外部引物合成需求都是一起合成，效果和质量的反馈方面，我们综合有内部使用和外部使用反馈，更全面。
11、只做常规的pcr，用什么纯化方式的引物呢?常规的pcr脱盐纯化就可以满足实验了。
12、引物测序时，单向、双向、测通之间的具体区别是什么呀？这个主要是根据待测目的序列的长度来决定的，如果待测目的序列700bp以内的话可以选择正向或者反向都行；1500bp以内的序列一般双向测序就可以了；如果是待测目的序列大于1500bp就可以填测通，这边会根据测序结果自动安排测序反应，直到完全测通，我们会默认测通后拼接。
13、不同纯化方法,你们收费不一样是吗不一样的，脱盐纯化<PEGA纯化<HPLC纯化。
DNA测序分析常见问题整理
二、模板对测序结果的影响
① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆
正常模板与噪音
PCR正常终止
PCR正常终止 后面的噪音峰
噪音信号高
终止峰
模板不纯（非特异性PCR产物）
● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序
非单克隆
特征：左边清晰，右边全部像杂合子 原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA
三、纯化对测序结果的影响
① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应）
染料峰
特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。
“钉子”峰
● 现象：四色并存突然拔起的 尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰 尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要 吸进注射器； – 样品纯化干净。
有机物污染（瀑布效应）
合成时部分引物 多一个碱基
合成时部分引物 少一个碱基
● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物
引物（模板）不纯
● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。
DNA测序中的一些常见问题和对策
其抗 <+ 抗体属中和抗 $%&’# 和 $%&’! 的共同抗原决定簇， 体， 中和病毒的能力最强， 能与 $%& 的 <+ 抗原特异结合， 结 果改变了病毒的表面结构， 阻断了病毒对宿主细胞的吸附，
［@］ 使病毒失去了感染能力 。本实验所用的 5678% 中既有能
识别 $%& 的 <;、 也有 <+ 抗原的型共同性特异性单克隆抗体， 能识别 $%& 的 <= 的型特异性单克隆抗体， 体外中和试验也 证明其中和效价为 #( 2 #( ， 具有很强的中和病毒的作用
［$， %］ 序， 都存在下列问题 。
点琼脂糖凝胶回收并用专用试剂盒纯化， 注意纯化后要进行 电泳检测。 # 测序信号提前共同终止， 测序反应无法继续进行
［@］ 、 常见原因： 模板 !"# 中有二级结构形成 8"?& 浓度不
当或模板浓度过大， 导致测序反应提前终止。 对策： 一般商售试剂盒中配套试剂很少出现问题， 若为 自制试剂， 可予替换或重新配制， 再重复实验。由于测序反 应要求模板必须为单链， 所以对于二级结构形成导致的测序 反应共同终止， 可以提高模板变性温度使之充分分解为单 链， 或加入甲酰胺使模板变性充分、 彻底。 $ 无正常测序信号 常见原因： 引物设计不当或模板 3A’ 含量过高。 对策： 测序引物通常分为通用引物和特异性引物。前者 是针对不同克隆载体设计的引物， 一般不会存在上述问题。 特异性引物是指与模板特异性且唯一性结合的引物， 设计原 则如下： （$） 引物长度 ! $= .B， 一般 %)%C .B； （ %） 3A’ 含量 ! 一般为 C)D<)D （ ；@） 避免引物自身形成互补； （ E） C)D ， @F 末 端为 3 或 ’ 更为合理。模板 3A’ 含量过高者可采用专门为 高 3A’ 含量模板设计的测序试剂盒。 靠近引物的区域， 其测序信号可能由于引物峰遮盖而无 法阅读， 是 测 序 的 难 点。可 以 尝 试 加 入 /*% G（ $)) HH64 , I
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
DNA测序常见问题分析及解决办法
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
关于DNA测序服务的说明
1、如需TA克隆后测序，提供PCR产物的量不少于50ul。我们在收到样品后，先进行回收纯化，再进行克隆实验。
2、目的基因亚克隆实验，请提供含有目的基因的质粒及亚克隆载体质粒，如果质粒量少请提供保存菌种，我们需要额外收取转化或质粒提取费用。我们在收到样品后，先进行预实验检测，检测结果与背景资料一致时开始实验。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul；已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
只测OD值不可靠
总量是否足够
测序出现双峰
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化或纯化不好。重新合成引物测序。
信号
信号迅速衰减或
中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚克隆成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
现象
可能原因
是否收费
收
不收
反应无信号或全部杂峰
引物与模板结合不好（引物或模板原因）
不收
质粒抽提未成功
质粒太大或活化方式不好、转化不好
不收
鉴定质粒或PCR浓度
建议50ul(pcr)/20ul(质粒)去离子水溶解
不收
帮助客户设计引物和序列拼接
不收
300bp以前中断或衰减
DNA测序过程可能遇到的问题及分析
DNA测序过程可能遇到的问题及分析对于一些生物测序公司（如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。
为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸ddNTP 终止反应的位置之前的A,A后的信号会迅速减弱。
N值情况一般是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰。
该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器377以下的测序仪无法正确判断出为何碱基。
有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
在序列的3’端易产生N值。
一个测序反应一般可以读出900bp以上的碱基（ABI3730可以达到1200bp），但是，只有一般600bp以前的碱基是可靠的，理想条件下，多至700bp的碱基都是可以用的。
一般在650bp以后的序列，由于测序毛细管胶的分辩率问题，会有许多碱基分不开，就会产生N值。
测序模板本身含杂合序列，该情况主要发生在PCR产物直接测序，由于PCR产物本身有突变或含等位基因，会造成在某些位置上有重叠峰，产生N值。
这种情况很容易判断，那就是整个序列信号都非常好，只有在个别位置有明显的重叠峰，视杂合度不同N值也不同。
测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以就看不到引物序列。
有两种方法可以得到引物序列。
1.对于较短的PCR产物（<600bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测通，可以在序列的末端得到该引物的反向互补序列。
对于较长的序列，一个测序反应测不通，就只能将PCR产物片段克隆到载体中，用载体上的通用引物(T7/SP6)进行测序。
载体上的通用引物与所插入序列间有一段距离，因此就可以得到完整的引物序列。
（完整版）甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）
（完整版）甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h 正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
测序常见问题解答
测序常见问题解答1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度.2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4—5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破.3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。
4．PCR产物直接测序有什么要求？1)．扩增产物必须特异性扩增，条带单一.如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；.2）必须进行胶回收纯化；3）DNA纯度在16—2.0之间.浓度50ng/ul以上.5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。
这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。
大多所谓的PCR"纯化试剂盒"实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。
对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。
6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。
使用凝胶回收试剂盒回收.产物用ddH2O溶解。
7．PCR产物直接测序的好处？A) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况.B) 省去克隆的实验费用和时间.C) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障.D) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变.8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：1).DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；2).溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。
测序过程常见问题分析与解答
测序过程常见问题分析与解答DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?答：溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的酶反应条件.如果DNA用缓冲液溶解后,在进行了测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。
提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃ 培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
与测序引物有关的问题：答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR 引物将是不适合用作测序引物的：（1）简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
测序常见问题及其分析
测序常见问题及其分析[复制链接]查看:593回复:21#字体大小: t T发表于 2009-05-04 16:29 |只看楼主1、PCR 产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）图1-1图1-2解决方法：将PCR 产物克隆到质粒（如T 载体）中挑单克隆测序，或将PCR 产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。
问题图2（PCR 产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）图2解决方法：主要原因是PCR 产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR 产物进行PAGE 纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。
问题图3（测序引物有碱基缺失）测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1 有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE 纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。
3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。
如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重叠峰(如图中箭頭所示)。
解决方法：建议将DNA 片段克隆到载体再测序。
4、polyA/T 和C/G cluster 导致的套峰和测序信号衰减图4-1图4-3图4-4RACE 测序时经常遇到图4-1 和图4-4 的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。
基因测序(PCR常见问题)
PCR常见问题PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tiangen）1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列该基因的保守区2.引物长度一般在15~30碱基之间。
测序过程常见问题分析与解答
测序过程常见问题分析与解答1、DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。
DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。
如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。
的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
2、提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。
如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。
提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。
PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。
3、提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。
我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。
平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。
这样既误时间，又浪费客户的样品。
一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。
而甘油保存菌则容易污染。
制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。
穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
4、与测序引物有关的问题答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。
应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：（1）简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
850KDNA甲基化芯片检测必须知道的十问十答
850KDNA甲基化芯片检测必须知道的十问十答Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（850K芯片），为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。
并为FFPE样本的检测改进了protocol，以获得更可靠和稳定的结果。
广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。
一、Illumina 850K芯片有哪些技术特点？1.全面的基因组覆盖范围：检测>853,000个CpG位点，全面覆盖CpG岛、启动子、编码区、开放染色质和增强子，此外还包括CpG 岛外的CpG位点，已知DMR位点，脱氧核糖核酸酶超敏位点以及miRNA启动子区域；2.高质量的数据：同时采用Infinium I及II探针设计，使检测范围最大化；3.分辨率高：单碱基分辨率，可以直接检测到发生甲基化的确切位点；4.可重复性高：自身技术重复相关性R2 > 0.98，850K vs 450K 交集探针间相关性R2 > 0.98；5.起始模板量低：仅需 250ng，大大节约了样品量；6.检测样本类型更广：不仅可以检测全血、细胞、新鲜/新鲜冷冻的组织、而且也可检测FFPE样本。
二、 Illumina 850K芯片样本要求？1.样品类型：组织、细胞、基因组DNA；2.样品纯度：OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净，不得有其它个体或其它物种的DNA污染；3.样品总量：每个样品总量推荐600 ng以上；4.样品溶剂：溶解在TE中；5.样品运输：DNA低温运输（-20℃），在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。
三. 850K芯片能不能用来检测羟甲基化？可以，一份样本需要分成两份处理，其中一份用高钌酸钾处理后，再用亚硫酸盐处理。
BS转化后可获得5mC和5hmC，而KRu04处理之后获得5mC，两者之间做差就可以得到5hmC。
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DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA 序列的前提下，改变遗传表观。
DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。
Roche GS FLX Titanium 、IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4均可以进行大规模DNA甲基化测序分析，由于IlluminaSolexa GA IIx测序仪具有数据读取量大、成本低等优势， IlluminaSolexa GA IIx测序仪在DNA甲基化测序方面得到广泛应用。
DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA 甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。
甲基化测序对样品有什么要求？
答：（1）请提供浓度≥10 ng/μg、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次富集的DNA量不够，建议将2~3次免疫沉淀的DNA合并在一起。
（2）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。
在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中，再将50 ml管放在封口袋中。
为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上，请使用
non-stick tube运输DNA ；建议使用冰袋运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
MeDIP富集DNA片段的流程？
答：甲基化DNA免疫沉淀法（Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）是一种高效富集甲基化DNA的方法。
主要通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀，形成富集。
其流程如下（图1）：
（1）将基因组DNA超声打断成400-500bp片段；
（2）加热变性，使双链DNA片段解链形成单链DNA样品；
（3）向变性后的单链DNA样品中加入5’-甲基胞嘧啶抗体；
（4）使用亲和层析分离（3）步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。
纯化得到甲基化DNA片段（MeDNA）。
甲基化测序文库构建方法？
答：通过使用5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，并结合Solexa高通量测序平台进行甲基化测序，首先需要对所富集的DNA片段进行前处理，构建测序文库。
其方法如下：（1）对富集的双链DNA进行末端修复；（2）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；（3）使用特定的测序接头连接DNA片段两端；（4）纯化连接产物；（5）高保真聚合酶PCR扩增连上接头的DNA片段；（6）检测测序文库。
MeDIP-seq比其他的甲基化研究方法有什么优势？
答：灵活度高：能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息；检测范围广：覆盖整个基因组范围的甲基化区域；精确度高：能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位；数字化信号：直接对甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
各种方法的优缺点如下：
哪些因素会影响甲基化测序结果的质量？
答：由于进行DNA甲基化测序前，需要对样品进行DNA免疫沉淀富集，富集过程中反应条件是否合适，直接影响到富集甲基化DNA的量，另外还需要保证处理过程中测序样品无污染，否则会严重影响测序结果的质量；DNA免疫沉淀富集后，如果DNA的量过少，需要进行PCR扩增，PCR过程会产生偏差，影响样本甲基化结果的分析。