miRNA操作规程

MiRNA表达谱单通道芯片标准操作规程1 目的本标准操作规程用于规范博奥哺乳动物和植物的MiRNA表达谱单通道芯片服务的操作。

2 范围本标准化规程适用于博奥哺乳动物和植物的MiRNA表达谱单通道芯片服务的全过程。

3 职责3.1 博奥MiRNA表达谱项目负责人：3.1.1 负责监督执行，并对该SOP中技术参数的准确性、操作规范的正确性负责。

3.2 博奥表达谱项目组实验人员：3.2.1 在整个实验过程中，根据《CapitalBio miRNA表达谱芯片操作卡片》的引导，严格执行本操作规程，并及时填写《CapitalBio miRNA表达谱芯片操作卡片》。

4程序4.1miRNA分离标准操作规程4.1.2.实验前准备工作4.1.2.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风10min；4.1.2.2 查看样品接收单，确定样品是细胞还是组织，每个样品是否做重复，以确定所要分离的total RNA量，见表4。

4.1.2.3将total RNA从－20℃冰箱取出，室温解冻后，vortex 5 sec ，瞬时离心（~5 sec），暂存于4℃。

4.1.3 操作步骤4.1.3.1根据total RNA浓度计算分离RNA所需体积。

如果体积小于100μL，则补加DEPC H2O 水至100μL，若RNA体积大于100μL，则需要60℃浓缩至100μL。

4.1.3.2 加入等体积即100μL PEG溶液，震荡10 sec，室温放置8min。

注：RNA样品补水至100μL后，加100μL PEG溶液之前，要确认4℃离心机在7min后是否空闲。

RNA溶液与PEG溶液混匀后，静置7min，立即离心。

时间要严格遵守，以免影响编写审核批准4.1.3.3 将样品放入4℃离心机，12,000离心15min。

4.3.4 小心吸取上清于另一新的1.5mLEP管(弃沉淀)，依次加入20μL 醋酸钠(PH5.2)，4μL DNAmate，560μL 无水乙醇，。

涡悬震荡15sec充分混匀，-20℃静置1h。

4.1.3.5 将样品从-20℃冰箱中取出，放入4℃离心机，12,000离心15min，弃上清。

4.1.3.6 加入1mL 75%乙醇，颠倒离心管，轻弹管底，使沉淀悬浮。

4.1.3.7 将样品置于4℃离心机，12,000离心5min，弃上清。

4.1.3.8 将样品置于微量台式离心机中，瞬时离心（~5 sec），收集溶液于管底；4.1.3.9 用移液器小心地吸去管底的液体。

4.1.3.10 打开超净工作台风机，使管底的残留乙醇挥发，只留miRNA在管中。

4.1.3.11 加入DEPC H2O溶解miRNA。

如果样品不做技术重复，则加12μL DEPC H2O,2ul用做定量，2ul留样；如果样品需要做技术重复，则加入20μL DEPC H2O2ul用做定量，2ul留样。

4.1.3.12 将miRNA溶液置于恒温金属浴上65℃加热5min，涡悬震荡5sec充分混匀。

4.1.3.13 将样品置于冰上3min，使管中的水蒸气凝集。

瞬时离心（~5 sec）收集溶液于管底。

4.1.3.14 吸取2μL miRNA样品于0.2mL EP管中，使用NanoDrop分光光度计定量并纪录，操作参见《分光光度计标准操作规程》。

其余样品暂存于4℃冰箱。

4.1.3.15取出4℃冰箱中的miRNA样品，将测定的miRNA样品浓度(ng/μL)，客户名称与日期在样品管的侧壁标注清楚，保存于-20℃冰箱备用。

4.2氨基芯片固定标准操作规程4.2.1 实验前准备工作4.2.1.1打开水浴锅，加热到65℃。

4.2.1.2配制0.5%SDS。

4.2.2操作步骤4.2.2.1 将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10S，芯片距水面距离为2-3cm，在空气中室温自然干燥，再进行一次水合。

4.2.2.2 将点有探针的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ 交联。

4.2.2.3 将芯片放在48℃预热0.5％SDS清洗10min，水平摇床80rpm晃动。

4.2.2.4 将芯片放在45℃预热蒸馏水中清洗1min，水平摇床80rpm晃动。

注：在洗液中清洗的时候，洗液盒里的液体不要过多，以免在摇动过程中溅出液体洒落在摇床上，引起摇床短路。

4.2.2.5 把芯片放在芯片清洗仪里干燥离心，以去除芯片表面的液体，芯片经过扫描背景均一无杂质即可用于杂交。

芯片扫描请参见操作请参见《LuxScan 10K-A扫描仪标准操作规程》。

如果背景很脏，进行下面的步骤。

注：芯片离心甩干前，要检查芯片是否两两平衡，离心时，有标签的一端的芯片朝下放置。

4.3miRNA表达谱芯片标记和杂交标准操作规程4.3.1实验前准备工作4.3.1.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风10min。

4.3.1.2 核查样品接收单，确定样品是细胞还是组织，每个样品是否做重复。

4.3.1.3取8ul上述分离好的miRNA ，分别加入下列试剂：表2 去磷酸化4.3.1.4轻轻吸打混匀各组分，放于37℃温育30min，100℃变性5min，冰浴2min后瞬时离心，收集所有溶液于管底。

4.3.1.5将10×buffer for T4 RNA ligase, 从－20℃冰箱取出，室温解冻后，vortex 5 sec ，瞬时离心（~5 sec），暂存于4℃。

4.3.2操作步骤4.3.2.1 取1.5 mL EP管，做好标记，按照下面反应体系（表10）依次加入各个溶液，并用移液枪轻轻吸打混匀。

表3 荧光标记实验反应体系4.3.2.2将离心管置于微量台式离心机中，以低于3000rpm的转速瞬时离心，在4℃冰箱中避光静置反应4 h。

4.3.2.3将反应体系补水至100 μL，依次加入下列成分：醋酸钠10 μL，DNAmate 4μL，无水乙醇280 μL。

涡悬震荡混匀，于-20℃冰箱中静置0.5h。

4.3.2.4 将样品置于离心机中，4℃条件下12,000 rpm离心15min；4.3.2.5弃上清，每管加入1ml 75% 乙醇溶液，轻轻颠倒离心管，使沉淀悬浮；注：乙醇沉淀miRNA过程中，得到的沉淀体积一般比较小。

弃上清的操作要小心，避免丢弃掉miRNA。

4.3.2.6再次置于离心机中，4℃条件下12,000 rpm离心5min；4.3.2.7 弃上清，于微量台式离心机中瞬时离心（~5 sec），用移液器吸去净残留上清；4.3.2.8 打开超净工作台风机，使管中的少量残留乙醇挥发；4.3.2.9 每管加入12μL DPEC水溶解（配制请见表12），vortex 15 sec，使沉淀充分溶解，瞬时离心（~5 sec），并取2ul进行定量，剩余10ul浓缩至8ul进行以下杂交实验。

表4 miRNA芯片杂交液的配制4.3.2.11 将8ul样品转移至配置好的杂交液中，95℃变性3min，冰浴3min，瞬时离心（~5 sec）；4.3.2.12将事先画好玻片与点阵位置的纸片放于桌面，玻片有标签的一面朝上放置；注：杂交前在两个blocks之间要贴上围栏，以保证两个blocks中的样品没有机会交叉污染。

4.3.2.13吸取21μL 杂交溶液转轻轻加到玻片的点阵位置，小心盖好盖玻片，避免气泡产生；4.3.2.14剪一段1 cm×4cm的滤纸片，放入杂交盒中，加150 μL蒸馏水将其浸湿；4.3.2.15将芯片轻轻放入杂交盒，密封严紧，于42℃空气浴杂交仪中过夜杂交。

4.4芯片清洗与扫描标准操作规程4.4.1 实验前准备工作4.4.1.1 配制洗液I（2 ×SSC，0.2% SDS）和洗液II（0.2 ×SSC）4.4.1.2 打开LuxScan 10K-A微阵列芯片扫描仪的红色和绿色激光预热激光器。

4.4.2操作步骤4.4.2.1 将已经配制好的洗液I倒入洗液盒中，在微波炉中加热稍高于42℃。

4.4.2.2 将杂交结束的芯片从芯片盒中取出，快速将盖玻片在洗液Ⅰ中去掉，然后把芯片放入装有洗液Ⅰ（已预热到42℃）的洗液盒里。

注：芯片杂交结束后，要先揭掉围栏，再清洗芯片，以防止围栏吸附的杂质污染芯片。

4.4.2.3 将洗液盒放在水平摇床上，以一定的速度缓慢清洗42℃ 4min 。

4.4.2.4 再预热洗液Ⅱ 稍高于42℃。

4.4.2.5 待4.4.3.3步骤结束后，将芯片用镊子夹起转入到装有洗液Ⅱ（已预热到42℃）的清洗盒中，放在水平摇床上缓慢清洗42℃ 4min 。

4.4.2.6芯片清洗完成后，放在50ml 锥形离心管中，1500rpm 离心1min ，除去玻片表面的液体，此时的芯片可以进行扫描。

4.4.2.7 芯片的扫描。

操作请参见《LuxScan 10K-A 扫描仪标准操作规程》 4.4.2.8 可先用40μm 的cy3通道预扫一下，如果背景很脏，进行下面的步骤。

4.4.2.9 将芯片放在42℃的洗液Ⅱ（或者无水乙醇）中清洗1min ，然后离心甩干。

4.4.2.10 同4.4.2.7。

5 引入文件《CapitalBio miRNA 表达谱芯片操作卡片》 《分光光度计标准操作规程》《LuxScan 10K －A 扫描仪标准操作规程》 6标记过程示意图7 附录7.1实验所需的试剂、耗材和仪器设备参见表5、表6、表7。

表6 实验所需耗材表7 实验所需仪器设备。