现代生物技术第三章 细胞工程

五wk.baidu.com细胞融合技术
2.微生物原生质体的制备与融合 2）微生物原生质体融合和再生 • 融合是把两亲本的原生质体混合在一起， 采用不同的方法进行，最常用的是PEG 融 合和电融合。 • 融合率＝融合子/两亲本原生质体再生菌落 的总数
五、细胞融合技术
3.植物原生质体的制备 1）取材与除菌 2）酶解 3）分离 4）洗涤 5）鉴定
微 生 物 细 胞 培 养
微 生 物 细 胞 杂 交
动 物 细 胞 培 养
动 物 细 胞 融 合
单 克 隆 抗 体
胚 核 胎 移 移 植 植
二、发展史
• 1838～1839年提出细胞学说； 1902年提出细胞全能性； 细胞全能性：植物细胞具有原植物的全部遗 传性，单细胞经人工培养，通过细胞分裂而 恢复成完整植株。 1904年用胡萝卜胚培养成株，三十年代获愈 伤组织。 1948年发现腺嘌呤，生长素对芽形成的影响， 建立腺嘌呤/生长素的比例控制芽根分化。
2、植物细胞培养
• 植物细胞培养与动物细胞培养相比，具最大 的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上 生长。 • 其培养基的成分由无机盐类、碳源、维生素、 植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复 合物质组成。包括植物生长所必需的16种营 养元素和某些生理活性物质。
2、植物细胞培养
植物细胞培养方法 单细胞培养、原生质体培养； 固体培养、液体培养（摇瓶悬浮培养和大 规模悬浮培养）。 • 悬浮培养是指把离体的植物细胞悬浮在液 体培养基中进行的无菌培养。
2、植物细胞培养
• 植物细胞体系建立的一般程序为：整体植株 株——植物组织或器官——外植体——在固 体培养基上诱发愈伤组织——愈伤组织继代 培养——悬浮培养。
2、植物细胞培养
基本操作过程： 一般利用次亚氯酸盐的稀溶液、酒精、升汞等消毒剂 对合适的植物材料进行表面消毒灭菌，在无面条件 下切取未受损伤或未被污染的组织或器官(即外植 体)，臵于固体培养基上培养，随着细胞增殖形成 不定型细胞团(即愈伤组织)，将此愈伤组织移入新 鲜固体培养基中继代培养或转入液体培养基中悬浮 培养。愈伤化时间随植物种类和培养基条件不同而 不同，慢的需要几周以上，一旦增殖开始，就可反 复继代培养，加速细胞生殖。继代培养可用试管或 烧瓶等，大规模悬浮培养可用传统的搅拌罐、气式 发酵罐。
1）培养基的组成
• 维生素C（抗坏血酸）：强还原能力，防组 织氧化变褐。 B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤 组织活力有关。 B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的 发育，高浓度会抑制生长。 B6（吡哆醇）：促根生长。 肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用， 但有助活性物质发挥作用。
1）培养基的组成
二、发展史
• 1956年发现激动素促芽形成效果高，促组培工作研 究； 六十年代从曼陀萝花药培养获植株建花培技术； 1972年细胞融合成功； 1912年培养动物细胞； 1958年获细胞融合（种间、腹水癌细胞+病毒） 六十年代初换核术成功； 1975年获杂交瘤； 我国70年代中开始细胞融合； 现有40多种花粉植株，在我国首次成功。
• 脱分化：已分化（或成熟）的组织又恢复到 无分化的初始状态。
在组织培养过程中，将已经分化的茎、叶、 花等外植体进行培养，使其形成愈伤组织， 回复到没有分化的状态。 再分化：在组织培养过程中，对处于脱分化状 态的愈伤组织进行培养，诱导其形成新的植 物体的过程。
• 外植体：在植物组织培养过程中，从植物体 上被分离下来接种到培养基上，供培养用的 原生质体、细胞、组织、器官等。 建立外植体的过程： 从植物组织（根尖、茎、芽、嫩叶、种子、 花粉等）分离外植体→灭菌消毒→切取并将 外植体接种于培养基上
常用的细胞固定化培养系统
平床培养系统
立柱培养系统
3、动物细胞培养
• 动物细胞培养是指离散的动物活细胞体外人 工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细 胞不出现分化，不再形成组织。 • 根据细胞是否贴附于支持物上生长的特性， 培养的细胞可分为两大类：悬浮型和贴附型。 • 悬浮型细胞是指生长时呈悬浮状态的细胞； 贴附型是指贴附于支持物上生长的细胞。 • 动物细胞培养的一般程序是：组织切碎-酶 处理得单个细胞-培养-再扩大培养。
•水
• 培养基大部分是水
来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水） 或去离子水。 目的：保持培养基成分完全人为控制。 • 作用：起媒介作用 组成作物体（占75～80%） 提供O、H元素 运输物质、调节渗透压
2）培养基的种类
• 按成分不同划分：
天然培养基：含有化学成分还不清楚或化学成分 不 恒定的天然有机物。 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而 成的培养基。
三、细胞工程的基本操作
1.
2. 3.
无菌操作技术
细胞培养技术
细胞融合技术
1、无菌操作技术
• 细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下 进行，实验操作成在无菌室内进行。无菌 室应定期用紫外线或化学试剂消毒，实验 前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲 室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做 好准备后方可进入无菌室，操作时实验者 的双手应戴无菌手套。 • 注意周围环境的卫生整洁。 • 生物材料、一切器械、器皿和药品应进行 灭菌或除菌。
细胞融合技术
– 制备原生质体 – 诱导细胞融合
• 化学法
• 物理法 • 生物法
– 筛选杂合细胞
四、细胞培养技术
1、微生物细胞培养
2、植物细胞培养
3、动物细胞培养
1、微生物细胞培养
1）培养基的组成 • 碳源 • 氮源 • 无机盐 • 维生素 •水
1）培养基的组成
• 碳源
• 蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多 糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；由其他谷物、 马铃薯、红薯、木薯等得到的糖类物质。 作用：维持培养基的合适渗透压； 构造微生物体； 参与新陈代谢。 注意:不同浓度影响细胞的增殖分化。
五、细胞融合技术
4.融合子的筛选 1）微生物融合子的筛选 2）植物融合子的鉴定 3）动物细胞融合子的鉴定
作业
• 1.什么是细胞工程？
• 2.植物细胞培养的方法有哪些？
第二节 植物细胞工程
• 植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，在 离体条件下进行培养、繁殖或人为地精细操 作，使细胞的一些生物学特性按人们的意愿 发生改变，从而达到改良品种或生产生物产 品的目的的一种技术。
• 根据物理状态分：
固体培养基 半固体培养基 液体培养基
2）培养基的种类
• 按用途划分：
基础培养基 加富培养基（营养培养基） 鉴别培养基 选择培养基 其他培养基：分析培养基、还原性培养基等
3）培养方法
（1）固体培养； （2）液体培养； （3）连续培养； （4）中间补料培养； （5）同步培养； （6）混合培养。
1）培养基的组成
• 维生素
• 维生素是生物体生长不可缺少的一种或数种极微量 的有机物质，但微生物在生长时，自身往往又缺乏 合成这种有机物的能力，因此，必须由外界提供。 与微生物关系较大的维生素，主要是B族维生素。 • 作用：是微生物体内各种酶活性基团的组成部分。 直接参与生物催化剂——酶的形成及蛋白质、脂肪 的代谢。
3、细胞融合技术
• 两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重 排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程 称为细胞融合。 • 细胞融合是细胞工程的重要基本技术，其主要过程 包括：①制备原生质体。由于微生物及植物细胞具 坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将细胞壁降解。动 物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合。两亲本细胞 (原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度；按1：1的 比例混合后，用物理、化学或生物的方法促进融合。 ③筛选杂合细胞。将上述混合液移到特定的筛选培 养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细 胞无法生长。以获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。
2、植物细胞培养
植物细胞培养方法 1）植物细胞悬浮培养法 分批培养法 半连续培养法 连续培养法
2、植物细胞培养
植物细胞培养方法
2）植物细胞固定化培养技术 • 所谓固定化细胞培养，即把细胞固定在一种惰性基 质，如琼脂、藻酸盐、聚丙烯酰胺、纤维或膜上面 或里面，细胞不能运动，而营养液可以在细胞间流 动，供应其营养。
五、细胞融合技术
• 细胞融合技术是指在一 定条件下，将两个或多 个细胞融合在一个细胞 的过程，细胞融合又称 细胞杂交。
五、细胞融合技术
1.细胞融合的方法 生物学法
化学融合剂法
电处理融合法
五、细胞融合技术
2.微生物原生质体的制备与融合 1）微生物原生质体的制备 • 为制备微生物的原生质体，必须有效地去除 细胞壁，根据各种微生物细胞壁的不同结构 和组成，可以用不同的方法来脱壁。目前， 常用酶法来脱壁。
第三章 细胞工程
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细胞工程的基本原理
植物细胞工程 动物细胞工程 微生物细胞工程
第一节 细胞工程的基本原理
一、细胞工程的内容
（1）定义
应用细胞生物学的方法，在体外条件 下以细胞为基本单位进行培养、繁殖， 或人为地使细胞某些生物学特性按人 们的意愿发生改变，从而达到改良生 物品种和创造新品种，加速繁殖动、 植物个体，或获得某种有用的物质的 过程。
无菌操作
杀菌和消毒 物理法 化学试剂 抗生素 超净工作台
2、细胞培养技术
• 细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌 条件下的保存和生长。虽然这些细胞培养在营养要 求等方面有许多差异，但作为细胞培养，它们也有 些共同之处。 • 首先，要取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以 外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用 一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时 还需要某些特定的酶对材料进行顶处理，以期得到 分散生长的细胞。 • 其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基并进 行灭菌。将生物材料接种于培养基中，最后将接种 后的培养基放入培养室或培养箱中培养。当细胞达 到一定生物量时应及时收获或传代。
2、植物细胞培养
• 广义的植物细胞培养是指在无菌条件下，将离体的 单个游离细胞在人工控制的环境里培养，以获得再 生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品 的一种技术。 • 食品工业意义上的植物细胞培养主要是指细胞悬浮 培养，即使游离的植物细胞或一些小的细胞团在液 体培养基中增殖并分离提取细胞产生的代谢产物。
植 物 细 胞 工 程
所采用技术 的理论基础
植物细胞的全能 性
植物组织培养 植物体细胞杂交
通常采用的 技术手段
• 细胞的全能性：生物体的细胞具有使后代细 胞形成完整个体的潜能的特性。 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特 有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体 所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的 每一个活细胞都应该具有全能性。
3、动物细胞培养
1）细胞培养基的组成
• 氨基酸 • 维生素 • 盐：钠、钾、镁、钙、氯等金属离子和酸根 离子 • 葡萄糖 • 有机添加剂 • 激素和生长因素
3、动物细胞培养
2）常用培养基 天然培养基 合成培养基 无血清培养基
3、动物细胞培养
3）动物细胞培养方法 悬浮培养 贴壁培养
固定化培养 大规模培养法
五、细胞融合技术
2.微生物原生质体的制备与融合 1）微生物原生质体的制备 • 原生质体制备之前，微生物细胞需经过种子培养、 振荡培养到一定的对数生长期，其菌量约为菌悬 浮液中4×l08个／mL时为宜，然后加溶菌酶在42℃ 轻轻振荡45min即形成原生质体，由于原生质体对 渗透压敏感，因此在琼脂培养基上涂布培养，原 生质体会在低渗条件下破裂失活，不能形成菌落， 曲落越少说明原生质体化效果愈好。 • 原生质体形成率＝原生质休数/未经酶处理的总菌 数。
一、细胞工程的内容
• 根据其研究对象不同，分为植 物细胞工程、动物细胞工程和 微生物细胞工程。 • 细胞是细胞工程操作的主要对 象。
– 原核细胞
• 细菌、放线菌
– 真核细胞
• 酵母菌、动物细胞、植物细 胞
细胞工程
植物细胞工程 微生物细胞工程 动物细胞工程
植 物 组 织 培 养
植 物 体 细 胞 杂 交
1）培养基的组成
• 氮源
• 来源：无机氮源（氨气、铵盐或硝酸盐等）和有 机氮源（氨基酸、蛋白质或尿素、蛋白胨、牛肉 膏、酵母膏等）。 作用：构成微生物细胞、蛋白质和核酸的主要元 素。 细胞生长分化需氮。
1）培养基的组成
• 无机盐
• 大量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以上。 微量元素：每升培养基含0.5毫摩尔以下。 大量元素：P、K、Mg、S、Ca等； 微量元素：钴、铜、铁、锰、钼、锌等。 作用：构成菌体的组成； 作为酶活性基团的组成部分； 调节微生物体内的pH值。