第五章 灭菌操作

（2）加压法
• 常规加压灭菌法 • 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底 驱尽后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力 为1kg／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～ 20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即 0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35分钟的方 法。 • 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机 构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的 灭菌。
• 此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼 睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作 人员在无菌室操作时应关闭紫外灯
（二）热灭菌
• 原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶）热 变性而得以实现。 • 热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机 压缩，提高压力。 • 空气压缩后温度能达到200度以上，保持一定 时间后，便可达到干热杀菌。
(二)灭菌设备 l、高压蒸汽灭菌锅 生产中使用高压蒸汽灭菌 锅的型号很多 手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培 种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽 培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶 (袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。
第三节
空气的净化
一、空气中微生物的分布
• 空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和 空气中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而 异。 • .北方气候干燥，寒冷，空气中的含菌量较多， 离地面越高，含菌量越少；一般每升高10米， 空气中的含菌量就降低一个数量级； • 城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌 量较少，一般城市空气中杂菌数为3000~8000 个／米3 。
• （二）实罐灭菌 • 将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达 到预定灭菌温度后，维持一定时间，再 冷却到发酵温度，然后接种发酵，这叫 做实罐灭菌，又称分批灭菌。 • 操作要点：
• （三）过滤除菌法 • 是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使 大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留， 从而达到除菌目的。
• 目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。 关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。 • 滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石 棉板过滤器（Seitz滤器）、素烧瓷过滤器 以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是 无法去除其中的病毒和噬菌体。
（二）消毒（disinfection）
• 从字义上来看，消毒就是消除毒害， 这里的“毒害”就是指传染源或致病菌 的意思，英文中的“dis-infection”也是 “消除传染”的意思。 • 所以，消毒是一种采用较温和的理化因 素，仅杀死物体表面或内部一部分对人 体有害的病原菌，而对被消毒的物体基 本无害的措施。
• 1、pH值的影响 • pH值对微生物的耐热性影响很 大，pH为6.0～8.0时微生物最 不易死亡， pH <6.0时氢离子 易渗入微生物的细胞内。
• 2、培养基成分 • 培养基的成分中，油脂、糖类、蛋白质 都是传热的不良介质，会增加微生物的 耐热性，使灭菌困难。 • 浓度较高的培养基相对需要较高温度和 较长时间灭菌。 • 高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性， 故较易灭菌。
消除高温有害影响的措施
• （1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时， 应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合 并； • （2）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐 先作分别灭菌，然后再混合，就不易形 成磷酸盐沉淀；
（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基 （如含糖组合培养基）可进行低压灭菌 （在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下 灭菌15分钟）或间歇灭菌； （4）在大规模发酵工业中，可采用连续加 压灭菌法进行培养基的灭菌
• 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多， 也有酵母，霉菌和病毒。 • 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰 尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为 103~104个／米3。 • 灰尘粒子的平均大小约0.6μ m左右，所以空气 除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1μ m ）
二、空气除菌
• 工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同 而异。 • 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格，一 般无需复杂的空所净化处理； • 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，进入发酵 罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和过滤除菌等 处理。
（三）防腐（antisepsis）
防腐就是利用某种理化因素完全抑制 霉腐微生物的生长繁殖，从而达到 防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （2）缺氧 （3）干燥 （4）高渗 （5）高酸度 （6）防腐剂
（四）化疗（chemotherapy）
• 化疗即化学治疗。它是利用具有高度选 择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对 宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿 主体内病原微生物的生长繁殖，借以达 到治疗该传染病的一种措施。 • 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。 最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺 胺类药物和中草药中的有效成分等。
（二）影响加压蒸汽灭菌效果 的因素
• （1）灭菌物体含菌量的影响。 • 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配 成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹 化学试剂配制成的组合培养基，含菌量低。
• （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 • 检验灭菌锅内空气排除度，可采用 多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时 装有压力表和温度计，其次是将待测气 体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听 到“扑扑”声而未见有气泡冒出，也可 证明锅内已是纯蒸汽了。
• 间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。 适用于不耐热培养基的灭菌。 • 方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸 煮15～60分钟，以杀死其中所有微生物的营养 细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残 留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过 夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达 到彻底灭菌的效果。
三、发酵对空气无菌程度 的要求
• 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无 杂质，无水，无油，正压等几项指标； • 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵 过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。 • 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许 有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为 N=10-3
四、空气除菌的方法
• • • • （一） 辐射杀菌 （二） 热杀菌 （三） 静电除菌 （四） 过滤除菌
（一）．辐射灭菌法
• 最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。2537Å 波长的紫外线具有极强烈的杀菌效力，它的主要 作用是使微生物的DNA分子产生的胸腺嘧啶的二 聚体，导致细胞死亡。 • 无菌室常用的紫外灯功率为30W，安装在操作台 上方一米左右高处，每次照射15-30min既可。 • 紫外线有很强的杀菌力，但穿透力很弱，一张薄 纸即可完全挡住紫外线，因此待灭菌物品必须置 于紫外光直接照射下，而且在一定范围内作用强 度与距离平方成反比。
• 3、培养基中的颗粒物质 • 培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反 之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对 培养基灭菌影响不大，但在培养基混有 较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体 时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。
五、灭菌的实际操作
• （一）空罐灭菌 • 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、 还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基 （或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为 空罐灭菌。 • 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
除菌的方法
• 培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高 压加热法） • 空气的过滤除菌 • 紫外线或电离辐射 • 化学药物灭菌
（一）高温杀菌作用的种类
• 高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核 酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它 可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏 细胞膜上的类脂质成分等。 • 湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由 于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更 易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而 加速其变性。
1．干热灭菌法， 将金属制品或清洁玻璃器皿放 入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时 后，即可达到彻底灭菌的目的。 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、 原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能 用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。
2．湿热灭菌法
• 2．常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是 用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适 于一般生产单位和专业户使用。大小可 根据需要而定，但最大的锅每次装料也 最好不超过500公斤。 3．烘箱 烘箱主要是用于玻璃器皿的干 燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。
第二节 培养基的灭菌
一、湿热灭菌的基本原理： 湿热灭菌是直接用蒸汽灭菌。蒸汽冷 凝时释放大量潜热，并具有强有强大的 穿透力，在高温和水存在时，微生物细 胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性 变性，致使微生物在短时间内死亡。
• 二.培养基灭菌温度的选择 用湿热灭菌方法对培养基灭菌时,加热 的温度和时间对微生物死亡和营养成分 的破坏均有作用.选择一种既能达到灭菌 要求又能减少营养成分被破坏的温度和 受热时间,是研究培养基灭菌质量的重要 内容.
分批灭菌 灭菌总时间=加热时间+保温维持时间+ 冷却时间 连续灭菌
四、影响培养基灭菌的因素
灭菌操作
第一节 消毒灭菌
• 控制有害微生物主要有以下几种措施
（一）灭菌（sterilization）
• 采用强烈的理化因素使任何物体内外 部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力 的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措 施等。 • 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指 菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀 死后，其细胞发生溶化、消失的现象 。
• 利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理 对制备大量无菌空气有特别意义。 • 实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相 对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌 以及管道长度等。
（三）静电除菌
• 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃， 同时也除去微生物。 • 原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除 尘灭菌目的。
• 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。 • 多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右 处理5～10min后即可杀死； • 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用 80℃以上的温度处理才能杀死； • 而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下 处理15min才能杀死。
（1）常压法
• 巴氏消毒法（pasteurization） 用于牛奶、啤酒、 果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种 消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病 原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而 又不影响它们的风味。 • 巴氏消毒法是一种低温消毒法 • 低温维持法：在63℃下保持30分钟可进行牛奶 消毒； • 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保 持15秒钟即可。
• （3）灭菌对象pH的影响 • （4）灭菌对象的体积。要防止用常规的 压力和时间在加压灭菌锅内进行大容量培 养基的灭菌。 • （5）加热与散热速度。这两段时间也对 灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使 科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌 操作中对这些技术细节都应加以注意。
（三）高温对培养基成分的有 害影响及其防止
连续加压灭菌法
• 在发酵行业里也称“连消法”。此法只 在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。 • 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不 断地进行加热、维持和冷却，然后才进 入发酵罐。培养基一般在135～140℃下 处理5～15秒钟。
培养基连ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ工艺流程图
连续加压灭菌法优点
①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又 可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了 原料的利用率，比“实罐灭菌”（120℃，30 分钟）提高产量5～10％； ②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所 以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的 利用率； ③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作； ⑤降低了操作人员的劳动强度。