课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
➢实验目的 从土壤中分离分解尿素的细菌并计数
培养基中以尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生
➢实验原理 物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿
素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所 以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
➢实验材料 小铁铲、培养皿、试管、移液管、锥形瓶等
（二）制备培养基 实验组：制备选择培养基 （尿素为唯一氮源的培养基）
筛选出能够分解尿 素的细菌
对照组：制备完全培养基 （牛肉膏蛋白胨培养基）
与选择培养基做对照， 检测选择培养基是否具 有选择作用
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
判断选择培养基是否 具有筛选作用
选择培养基 完全培养基
➢实验步骤——【3】样品稀释与涂布
（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液
第一次做该实验时，可以将稀释的范围放宽一点，如可 以将103 ~ 107分别涂布到平板上培养。保证获得菌落数 在30～300之间、适于计数的平板
➢4】微生物的培养与观察
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
➢实验步骤 实验结果
实验流程：
土壤取样 制备培养基 样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察
菌落计数
（一）土壤取样 从富含有机物、潮湿、酸碱度适中的土壤中取样。铲 去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的
信封中。 铁铲和信封都要灭菌
“微生物的天然培养基”
数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌 细菌适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤 中生长，绝大多数分布在约3~8cm的土壤层。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
计算公式： 每毫升原液含菌数=400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数
2.间接计数法（活菌计数法-菌落） （1）常用方法：稀释涂布平板法。 （2）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的 一个菌落是由一个活菌繁殖而成的。
培养基类型 实验组 以尿素为唯一
氮源的培养基
是否接种 目的
分离尿素
是
细菌
结果 只生长尿素细菌
对照组 牛肉膏蛋白胨
是
判断该培养基 生长多种微生物
培养基
有无选择性
二、研究思路 （一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（二）统计菌落数目
1、显微镜直接计数： 利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
不加有机碳源 不加氮源 加入青霉素 加高浓度食盐 不加C、N源 石油是唯一碳源
自养微生物 固氮微生物 酵母菌和霉菌 金黄色葡萄球菌
自养固氮菌 能消除石油污染的微生物
4、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
4、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
二、研究思路
（一） 筛选菌株 （二）统计菌落数目 （三）设置对照
（一）筛选菌株
1、 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温 （930C）的DNA聚合酶。
3、例如： ①判断培养基中是否有杂菌污染：
(完整版)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案)
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数★课题目标（一）知识与技能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数（二）过程与方法分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性（三）情感、态度与价值观形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯★课题重点对土样的选取和选择培养基的配制★课题难点对分解尿素的细菌的计数★教学方法启发式教学★教学工具多媒体课件★教学过程（一）引入新课上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。
下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。
（二）进行新课1．基础知识1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 ，这是因为细菌能合成脲酶。
1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。
〖思考2〗该培养基对微生物具有（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。
1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2.制备培养基：
制备两种培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）—对照组 尿素为唯一氮源培养基（选择培养基）-实验组
将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨 培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养 基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以 作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选 择作用。
大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 大肠杆菌的菌落呈黑色,有或无金属光泽
六.结果分析与评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是 否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明 培养基没有被杂菌污染；
牛肉膏蛋白胨培养基(完全培养基)中菌落数目 明显多于选择培养基，说明选择培养基已筛选出一 些菌落。
因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌 作进一步的鉴定。(筛选后必鉴定)
五、课外延伸
1、对分离的菌种作进一步的鉴定，还 需要借助 生物化学 的方法。
2、在细菌分解尿素的化学反应中，细 菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。 氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升 高 。因此，我们可以通过检测培养 基 pH 变化来判断该化学反应是否发 生。
以防被
致病微生物
感染，实验
后一定要洗手。
当堂训练
1.使用选择培养基的目的是（ C ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加
以区别
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分
别是( D )
A.CO2和N2 C.CO2和尿素
B.葡萄糖和NH3 D.葡萄糖和尿素
（二）统计菌落的数目
采用什么方法可以统计每克土壤样品中究 竟含有多少这样的细菌呢？
2-2课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数研究思路（一）筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为，这是因为细菌能合成。
2、PCR技术中使用的耐高温的酶是，它是从中分离出来的。
科学家能从中把筛选出来是因为，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是_ 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖本课题使用的培养基——见旁栏资料〗〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的的是，琼脂的作用是。
〖思考2〗该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是。
3、选择培养基是指特定种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基（二）统计菌落数目1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是。
除此之外，也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量2、统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够时，_ 。
通过统计，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
因此，恰当的是成功地统计菌落数目的关键。
3、．为保证统计结果准确，通常将都涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。
4、在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。
在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果，结果，意味着操作有误，需要重新实验。
〖思考3〗统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是_ 〖思考4〗第位同学的结果接近真实值。
你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需；第二位同学_ 。
5、统计的菌落数比活菌的实际数目。
因为当两个或多个细胞时，平板上观察到的只是菌落。
因此，统计结果一般用来表示。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（1课时）主备人：【课程目标】：研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定.【课程重点】：对土样的选取和选择培养基的配制【课程难点】：对分解尿素的细菌的计数【学习过程】：一．基础知识1．尿素是一种重要的氮肥，农作物_______（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为__________________ ，这是因为细菌能合成________ 。
分解尿素的细菌主要有，，。
2．科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为______________________________，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是______________________________________ __________________________________________________________________。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
3．选择培养基是指 __________ 。
〖思考1〗P22左上方，在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是________，提供氮源的的是___________ ，琼脂的作用是_____________。
〖思考2〗该培养基对微生物____________（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是______________________________ 。
例如：缺乏__________的选择培养基可用来分离固氮微生物缺乏__________的选择培养基可用来分离自养微生物二．统计菌落数目1．在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是_______________ 。
除此之外，_______________________也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
人教版教学课件土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2)
脲酶
+ H2O
+ CO2
NH3
.筛选菌株
1
.统计菌落数目
A
C
D
4.下列说法不正确的是（ ） A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（ ） A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐
[三]样品的稀释
应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数
目标导航 1.能利用选择培养基分离细菌。 2.能运用活菌计数法测定土壤中分解尿素细菌的数量。
1 预习导学 挑战自我，点点落实
2 课堂讲义 重点难点，个个击破
3 对点练习
即时训练，体验成功
预习导学
挑战自我，点点落实
一、研究思路
1.筛选菌株
(1)PCR技术要用到一种关键酶—— Taq DNA聚合酶 ， 这
3.2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件， 一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将 这类微生物选择出来？ 答案 配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后 用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生 存的就是能分解石油的微生物。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
10
四、课题延伸 分解尿素的细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了氨，使培养基 的碱性增强。在以 尿素为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂培养细菌，若指示剂变 红 ，可以初步鉴定该种细菌 能够分解 尿素。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
11
预习诊断
判断正误：
(1)选择培养基只允许特定的微生物生长，而抑制或阻止其他微生
一、选择培养基
1.选择培养基的制作方法
(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，依据某些微生物对某
些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生
物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可
抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可
将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线
目在30～300的平板
操作成功
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数一、筛选菌株的思路1、自然界中目的菌株的筛选（1）原理：根据对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
2、实验室中目的菌株的筛选（1）原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。
尿素是一种重要的农业氮肥，尿素不能直接被农作物吸收，只有通过土壤中的细菌将尿素分解为氨后，才能被植物利用，土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
（3）实例：①以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离出分解尿素的细菌，因为只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用其中的氮元素。
②加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
③加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
④无氮源培养基可以分离固氮微生物。
⑤石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。
⑥将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。
二、统计菌落数目1、常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
（1）原理：样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有的活菌数。
(2)计算公式：每克样品中的菌株数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积，即(C÷V)×M。
（3）注意事项:a．为了保证结果准确，每个稀释度涂布至少 3 个平板作为实验重复，求其平均值（平行重复原则）。
选择菌落数在 30～300 的平板进行计数。
设置重复实验的目的是：排除偶然因素对实验结果的影响。
b．稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2-2课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数研究思路（一）筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为，这是因为细菌能合成。
2、PCR技术中使用的耐高温的酶是，它是从中分离出来的。
科学家能从中把筛选出来是因为，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是_ 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖本课题使用的培养基——见旁栏资料〗〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的的是，琼脂的作用是。
〖思考2〗该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是。
3、选择培养基是指特定种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基（二）统计菌落数目1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是。
除此之外，也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量2、统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够时，_ 。
通过统计，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
因此，恰当的是成功地统计菌落数目的关键。
3、．为保证统计结果准确，通常将都涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。
4、在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。
在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果，结果，意味着操作有误，需要重新实验。
〖思考3〗统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是_ 〖思考4〗第位同学的结果接近真实值。
你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需；第二位同学_ 。
5、统计的菌落数比活菌的实际数目。
因为当两个或多个细胞时，平板上观察到的只是菌落。
因此，统计结果一般用来表示。
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案
高中土壤中分解尿素的细菌的分离与计数及答案教案YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数要点展示1．研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。
2．能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数。
要点突破一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。
应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数核心知识要点1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
2．实验流程(1)土壤取样→富含有机质的土壤表层土(2)样品的稀释→通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板(3)接种→用稀释涂布平板法接种(4)培养⎩⎪⎨⎪⎧细菌：30～37 ℃培养1～2天放线菌：25～28 ℃培养5～7天霉菌：25～28 ℃培养3～4天(5)观察→根据菌落的特征区分微生物 (6)计数→统计菌落的数目(7)计算→根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M 代表稀释倍数]”进行计算【重难详解】1．选择培养基四种常见制备方法或实例 方法一 加入某些特定物质2．两种计数方法的比较【解析误区】1．“选择菌落数在30～300的平板”的两个提醒用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。
解题时易出现以下误解： (1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。
错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。
(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。
可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300之间”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、理论基础1．筛选菌株(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
2．统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有和。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：1．取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。
应先 3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察将10g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，将土样以1、101、102…… 依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数ppt课件
原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或 者是混入了其他的含氮物质)
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方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验
结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误； 如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。
方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情 况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是 否受到污染。
比浊法（原理是在一定范围内，菌的
悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光 密度成正比，菌越多，光密度越大。因此 可以借助于分光光度计，在一定波长下， 测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌 量。）
膜过滤法（当样品中菌数很低时，可
以将一定体积的湖水海水或饮用水等样品
通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，
并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜
小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。
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二.实验的具体操作
㈠.土壤取样 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
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[三]样品的稀释
◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行
题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与
另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，
因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至
少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服
力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置
的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有
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第二节：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案)一.菌种的筛选与选择培养基1.菌种的筛选：(1)自然界中目的菌株的筛选：①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。
(2)实验室中目的菌株的筛选：①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
②方法：利用选择培养基分离。
a.可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。
如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。
b.可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势。
2.选择培养基：(1)概念：指允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。
(2)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某一化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(3)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。
(4)选择培养基的用途：使混合菌株中的目的菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。
(5)实例：在培养基中以尿素为唯一的氮源，可得到能利用尿素的微生物。
(所需培养基的配方如表所示) 培养基组成含量提供的营养或作用KH2PO4 1.4 g无机盐Na2HPO4 2.1 gMgSO4·7H2O 0.2 g葡萄糖10.0 g 碳源尿素 1.0 g 氮源、能源琼脂15.0 g 凝固剂水容到1 000 mL 氢元素、氧元素备注：该培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选出能分解尿素的微生物。
(6)常见的选择培养基①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③无氮源培养基可以分离固氮微生物。
④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物的目的。
⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。
思考1：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。
二.土壤中分解尿素的细菌的分离1.实验流程(1)土壤取样：①土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。
同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
②要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。
③取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。
(取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌)(2)制备培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用。
(3)样品的稀释与涂布平板：①取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。
将细菌分散，制成101倍土样稀释液。
用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。
依次类推，制成103、104、105、106、107倍土壤稀释液。
(稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目)②取样涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。
按照浓度从107~103的顺序涂布平板，不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于计数；如测定土壤中细菌的数量时，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量时，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板涂布培养)。
如下图：备注：★图中1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。
★实验时要对所用的平板、试管作好标记。
如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
(4)微生物的培养与观察：①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。
随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。
比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。
在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。
仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。
2.结果分析(1)是否有杂菌污染：①对照组培养基上无菌落生长⇒未被杂菌污染②实验组培养基上菌落数偏高⇒被杂菌污染③实验组培养基上菌落形态多样，菌落数偏高⇒培养基上可能混入其他氮源 (2)选择培养基是否有筛选作用：牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目⇒选择培养基具有筛选作用 (3)样品的稀释操作：如果得到了2个或2个以上菌落数在30~300的平板⇒操作成功 (4)重复组的结果：若选取的是同一种土样，统计结果应该接近。
3.分解尿素的细菌的进一步鉴定(1)鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基碱性增强，PH 升高。
因此可以通过检测培养基PH 的变化来判断该化学反应是否发生。
即：CO(NH 2)2+H 2O ――→脲酶CO 2＋2NH 3(2)鉴定方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，则PH 升高，说明该种细菌能分解尿素。
三.微生物数量的测定方法1.稀释涂布平板法(或活菌计数法或间接计数法)(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL 接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。
为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。
②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
③计算公式：每克样品中含菌数＝(C÷V)×M 。
C ：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V ：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M ：代表稀释倍数。
(3)统计方法：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计多个平板，然后求取平均值。
(4)主要用具：培养基、涂布器(5)计数依据：培养基上的菌落 (6)优点：计数的是活菌(7)缺点：操作较复杂，有一定误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数低。
备注：用稀释涂布平板法计数微生物时注意事项①稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
②计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
③间接技术法统计的菌落数往往比实际数目低，原因有：★当两个或多个细菌连在一起繁殖时，平板上观察到的只是一个菌落。
★统计结果只是活细菌产生的菌落数，而不包括死细菌的数目。
④为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30~300的平板进行计数，要设置重复组，取其平均值。
2.显微镜直接计数法(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)方法：用血细胞计数板计数。
血细胞计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm 2和高0.1 mm 的计数室，在1 mm 2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。
如图所示：(3)主要用具：显微镜、血细胞计数板 (4)优点：计数方便、操作简单(5)缺点：死菌、活菌都计算在内，统计的细菌数往往比实际值偏大。
(5)计算公式：每毫升培养液中细胞个数＝(中方格中的细胞总数中方格中小方格个数)×400×104×稀释倍数。
(6)显微镜直接计数的操作步骤：①用擦镜纸擦净血细胞计数板，在计数室上面加盖盖玻片。
②摇匀菌液，用滴管吸取菌液在盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入计数室。
③用显微镜观察并将计数室移至视野中央。
④计数：计数5个中格(规格：25×16)的总菌数(若是规格为16×25，则计数4个中格)。
按照计算公式求得每毫升菌液中的含菌数。
(备注：对于压边的细胞，只计数相邻的两边及其夹角上的细胞即可) 3.滤膜法补充：1.设置对照和重复的比较 比较项目 对照重复目的 排除非测试因素对实验结果的影响 排除偶然因素对实验结果的影响 实例空白对照：确定培养基制作是否合格同一稀释度涂布至少3个平板2.常用的对照方法： 对照方法 概念举例空白对照对照组不做任何处理在验证甲状腺激素功能的实验中，给甲组小蝌蚪饲喂含甲状腺激素的饲料(含测试因素——甲状腺激素，为实验组)，给乙组小蝌蚪饲喂等量的不含甲状腺激素的饲料(不含测试因素，为空白对照) 自身对照对照组和实验组都在同一研究对象或过程中进行，不另设对照组在观察植物细胞的质壁分离和复原实验中，有两次对照：第一次是在高浓度溶液处理下，质壁分离状态与自然状态形成对比；第二次是在低浓度溶液处理下，复原后状态与质壁分离状态形成对照相互对照 不单独设置对照组，而是几个实验组相互对照，比较得出相应的实验结论 在探究酶的最适温度或PH 时，设置一系列温度或PH 梯度，对比各温度或PH 下酶的活性高低，即可得出结论 标准对照不涉计对照实验，而是用标准值或正常值作为对照在亚硝酸盐含量的测定实验中，样品处理液与各种浓度的标准显色液的对照条件对照指虽给对象施以某种实验处理，但这种处理是作为对照组意义的，或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的在验证甲状腺激素功能的实验中，实验设计方案如下： 甲组：饲喂甲状腺激素(实验组) 乙组：不饲喂甲状腺激素(空白对照) 丙组：饲喂甲状腺激素抑制剂(条件对照)思考2：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位:株/kg)是不同的，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离,思考3：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？ 提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。