树突状细胞

器材
（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血 ）水平式离心机（2）显微镜（3 球计数板、血盖片（4 球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻 片（5）定量移液器、洗耳球（6 片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度 离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8 离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8） 小滤纸、擦镜纸
试剂
3、培基第3 天换液，轻轻吸去原培养液，加入 、培基第3 等量含有IL等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鲜1640 培氧液， GM的新鲜1640 继续置CO2 继续置CO2 孵箱中培养。 4、 促树突状细胞成熟：单核细胞经与IL-4 和 促树突状细胞成熟：单核细胞经与ILGM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成树突 GM的共同孵育，7 状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培养液，更换等量的含有 GMIFNIFN-α的RPMI1640 培养液，继续置5%CO2 孵箱 培养液，继续置5%CO2 中，37℃培养，至第9 中，37℃培养，至第9 天时可获得成熟的树突 状细胞。
基本原理 细胞因子GM细胞因子GM-CSF 和IL-4 使血液中单核细胞分化成树突状细 IL胞，并用IFN胞，并用IFN-α促进树突状细胞的成熟。 试剂和材料 ● 新鲜的外周（肝素）抗凝血液 ● 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液 ● 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)、hrIL-4、hrIFN-α。 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)、hrILhrIFN●培养液： （1） RPMI1640 全培基：RPMI1640+10% 胎牛血清（ FCS、 全培基：RPMI1640+10% FCS、 热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸钠+5×105 丙酮酸钠+5× mol/L 2 巯基乙醇。 （2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基+ILRPMI1640/IL-4/GM-CSF:即 全培基+IL4(40ng/ml)+GM4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml). （3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基+ IFN-α（1 RPMI1640/IFN-α:即 全培基+ IFN10ng/ml）。 10ng/ml）。
树突状细胞(dendritic 树突状细胞(dendritic cell,DC) 是一 类具有树枝状突起的抗原呈递细胞，其分布 广泛，由骨髓中的髓性多能干细胞发育而成， 在免疫应答过程中至关重要。它是原发性混 合淋巴细胞反应中的主要刺激细胞，可激活 Th 细胞发生增殖反应，而且还能刺激产生TC 细胞发生增殖反应，而且还能刺激产生TC 细胞。树突状细胞呈递抗原给T 细胞。树突状细胞呈递抗原给T 细胞提供稳 定的微环境。
检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等 量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用 载玻片在显微镜下计数100~200个单个 载玻片在显微镜下计数100~200个单个 核细胞中着色的死细胞数。
实验结果记录与分析
1.计算细胞回收率（%） 1.计算细胞回收率 计算细胞回收率（ 分离后单个核细胞总数×100%分离前单个核细胞总 分离后单个核细胞总数×100%分离前单个核细胞总 数 2.计算单个核细胞纯度（%） 2.计算单个核细胞纯度 计算单个核细胞纯度（ 分离后单个核细胞总数× 分离后单个核细胞总数×100% 分离后白细胞总数 3.计算细胞活力（%） 3.计算细胞活力 计算细胞活力（ 分离后活细胞数×100%分离后细胞总数 分离后活细胞数×100%分离后细胞总数
（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释 ）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释 的全血，比重：1.077±0.001）（3 液（市售，比重：1.077±0.001）（3） Hanks液（4）白细胞稀释液（5 Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5% 胎盘蓝
小鼠淋巴细胞的分离与培养
1. 拉颈处死小鼠，置70%酒精中浸泡5分钟消毒，然后移入超 拉颈处死小鼠，置70%酒精中浸泡5 净台。 2. 打开腹腔，无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5-10mlDMEM不完 打开腹腔，无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5 10mlDMEM不完 全培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组 织。 3. 将脾脏移入另一个盛有5-10ml DMEM不完全培养液的平皿中， 将脾脏移入另一个盛有5 DMEM不完全培养液的平皿中， 轻轻漂洗后置于100目细胞筛用滴管拉碎，使脾细胞通过筛 轻轻漂洗后置于100目细胞筛用滴管拉碎，使脾细胞通过筛 孔被挤压入培养液中，反复冲洗，以取得单个细胞悬液。
DC细胞培养
1.制备单个核细胞； 1.制备单个核细胞； 2.调整单个核细胞浓度为1*106/ml,加入 2.调整单个核细胞浓度为1*10 /ml,加入 含hrIL-4、GM-CSF的RPMI1640进行 hrIL- GM-CSF的RPMI1640进行
培养，5%CO2,37℃,3天。 培养，5%CO2,37℃,3天。
用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层 （含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入 刻度离心管内。 在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入 Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在 Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在 离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2 淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。 用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。 Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另 一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计 数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞 数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞 数（/ml）。 数（/ml）。
操作步骤
1.在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks 1.在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml 液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有 1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液 1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液 面上。 2.将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm） 2.将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm） 20分钟。 20分钟。 3.用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血， 3.用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血， 计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细 计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细 胞总数（/ml）。 胞总数（/ml）。
小鼠淋巴细胞的分离与培养
4. 将脾细胞悬液缓缓加入到已装有淋巴细胞分离液的10ml 将脾细胞悬液缓缓加入到已装有淋巴细胞分离液的10ml 离心管中（脾细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为1:1）， 离心管中（脾细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为1:1）， 然后2000rpm/min离心20分钟； 然后2000rpm/min离心20分钟； 5. 收集分离出的脾细胞，置于10ml的离心管内加入DMEM不 收集分离出的脾细胞，置于10ml的离心管内加入DMEM不 完全培养液吹打。取少量用于显微镜下计数，同时 1500rpm/min离心10分钟，弃上清； 1500rpm/min离心10分钟，弃上清； 加入适量完全培养液 （DMEM液+10%小牛血清），将细胞重悬，调整细胞浓度 DMEM液+10%小牛血清），将细胞重悬，调整细胞浓度 为1×106/ml。 106/ml。 6. 然后移入培养瓶，放入37oC ，5%CO2培养箱培养。 然后移入培养瓶，放入37oC 5%CO2培养箱培养。
外周血单个核细胞的分离— 外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在 其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位 置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周 血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼 此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重 大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重 大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重 均大于1.090。因此，若用比重为1.077±0.001的分 均大于1.090。因此，若用比重为1.077±0.001的分 离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收 集外周血单个核细胞。