免疫学实验设计

目的
气道炎性细胞浸润与粘附分子的关系近几年日益受到重视。

而细胞粘附分子受多种因素的调节，其中细胞因子起至关重要的作用。

嗜酸性粒细胞表面粘附分子L-选择素（L-selectin，CD62L）和极迟抗原-4（very late antigen-4，VLA-4，CD49d）是介导其与血管内皮细胞粘附的重要因素。

L-选择素介导白细胞与血管内皮细胞的初始粘附；VLA-4介导嗜酸性粒细胞与血管内皮细胞的牢固粘附，从而构成了哮喘时嗜酸性粒细胞气道浸润的重要条件。

【1,2】TNF α可调节嗜酸性粒细胞与脐静脉血管内皮细胞之间的粘附，TNF α活化的血管内皮细明显增强其与嗜酸性粒细胞的粘附【3】。

我们已往的实验发现【4】：TNF α能刺激气道平滑肌细胞分泌内皮素-1，而内皮素-1又可诱导肺的成纤维细胞分泌GM-CSF，初步证实了TNF α及其与气道基质细胞的相互作用在哮喘中的价值。

但是，TNF α是否为哮喘时特异细胞因子尚未有确切的结论。

为此，实验采用双色免疫荧光流式细胞技术观察了TNF α对人外周血嗜酸性粒细胞表面粘附分子L-选择素和VLA-4表达的影响，并与嗜中性粒细胞作以比较，以了解TNF α对嗜酸性粒细胞粘附分子表达是否有选择性作用及TNF α在气道炎症中的意义。

实验步骤
材料与方法
1.1仪器和单抗FACScan流式细胞仪。

荧光素直接标记的抗人CD15-FITC，CD49d-PE，CD62L-PE及Isotype单抗,TNF α。

1.2实验分组与处理取健康人外周肝素抗凝血，按以下分组进行处理：对照组（Control group）；TNFα 1组：TNF α终浓度为100u／ml；TNFα 2组：TNF α终浓度为1 000u／ml。

100μl 外周抗凝全血经TNFα 37°C30min温育后，分别加入CD15-FITC／CD62L-PE和CD15-FITC ／CD49d-PE单抗10μl，室温孵育30min，用红细胞裂解液（0．155mmol／L NH4Cl，0．01mol ／L KHCO3，0．1mmol／L EDTA，pH7．4）裂解红细胞，至透明时离心获取有核细胞，用PBS（pH7．4）洗2次，1％多聚甲醛固定，3d内上机测定。

在前散射和侧散射的二维Dot-plot图中，划出粒细胞区，然后对粒细胞的荧光强度作Dot-plot图，以阳性细胞百分率表示实验结果［5］。

1.3统计学处理用GB-stat统计学软件对实验结果进行统计学处理，两样本均数的显著性比较用Student’s t检验。

2.预期结果
相比实验组而言，对照组1的人外周血粒细胞群体中CD15＋细胞CD49D表达较低，而CD15－细胞CD49D表达明显增强，且TNFα不同剂量组间均数比较有统计学意义( P < 0. 05 ) 。

相比实验组而言，TNFα可增强CD15＋和CD15－细胞CD62L的表达，但TNFα不同剂量组间均数比较无统计学意义( P > 0. 05)
讨论
3.1粒细胞群体中CD15－细胞是否为嗜酸性粒细胞据文献报道，正常人外周血嗜中性粒细胞在静态下不表达VLA-4，在活化状态下也只有极少量表达，而嗜酸性粒细胞大量表达，【6,7】因此有人建议VLA-4可作为嗜酸性粒细胞的特异标志。

CD15主要表达在嗜中性粒细胞，在嗜酸性粒细胞中也有少量表达。

若CD15＋细胞中VLA-4表达率低，说明CD15＋细胞主要为嗜中性粒细胞；而在CD15－细胞中，VLA-4表达率高，说明在CD15－群体中主要为嗜酸性粒细胞（无法排除少量的嗜碱性粒细胞）。

因此认为在流式细胞仪分析时，粒细胞群体中CD15－细胞主要是嗜酸性粒细胞。

3.2TNFα诱导嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞L-选择素表达的意义炎性细胞浸润主要经历以下历程：白细胞沿血管内皮的滚动，即初始粘附，其中白细胞表面的L-选择素起重要的介导作用；然后是血管内皮细胞活化后的牢固粘附，主要由CD11a或CD11b／ICAM-1（细胞间粘附分子-1）及VLA-4／VCAM-1（血管细胞间粘附分子-1）两条粘附途径所介导。

事实上，只有与血管内皮细胞粘附的白细胞才能穿越血管内皮，进一步导致白细胞的组织浸润。

若符合预期结果，表明TNFα对嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞表面的L-选择素都有上调表达的作用，并且对嗜酸性粒细胞具有选择性作用的VLA-4表达亦有上调作用。

这说明TNFα对L-选择素介导的嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附没有选择性作用，TNFα是哮喘时气道嗜酸性粒细胞浸润的特异调节因子。

L-选择素介导嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附，且对两种白细胞没有选择性作用。

参考文献
［1］Dobrina A，Menegazzi R，Carlos TM，et al．Mechanisms of eosinophil adherence to cultured vascular endothelial cells：eosinophils bind to the cytokine-induced endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via the very late activation antigen-4 integrin receptor．J Clin Invest，1991，88：20
［2］刘金保，冉丕鑫，钟南山.粘附分子与哮喘.国外医学呼吸疾病分册，1996，2：81 ［3］Kitayama J，Fuhlbrigge RC，Puri KD，et al．P-selectin，L-selectin，and α 4 intigrin have distinct roles in eosinophil tethering and arrest on vascular endothelial cells under physiological flow conditions．J Immunol，1997，159：3929
［4］Xu J，Zhong NS．The interaction of tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 in pathogenetic models of asthma．Clin Exp Allergy，1997，27：568
［5］刘金保，冉丕鑫，钟南山.人外周血T淋巴细胞增殖过程中表面粘附分子表达的动态变化.中国免疫学杂志，1997，13（专刊）：148
［6］Lamas AM，Mulroney CM，Schleimer RP．Studies on the adhesive interaction between purified human eosinophils and cultured vascular endothelial cells．J Immunol，1988，140：1500 ［7］Weller PF，Rand TH，Goelz SE，et al．Human eosinophil adherence to vascular endothelium mediated by binding to vascular adhesion molecule-1 and endothelial leukocyte。