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第一章基因工程第一节基因工程概述

操作环境

操作

对象

操作

水平

基本过程结果

生物体外基因

分子

水平

剪切→拼接→导入→表

达

人类需要的基因产物

由于基因工程是在DNA 分子水平上进行操作,因此又叫做重组 DNA 技术。

二．基因工程的基本工具

（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）

1.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

2.功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两

个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3.结果：经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

（二）“分子针线”——DNA 连接酶

1.分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶两类

2.功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

★两种DNA 连接酶(E·coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶)的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键

②区别：E．coIiDNA 连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；

T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。

DNA 连接酶DNA 聚合酶

不同点

连接的

DNA

双链单链模板不要模板要模板

连接的

对象

2 个DNA 片段单个脱氧核苷酸加到已存在的单

链DNA 片段上

相同点作用实

质

形成磷酸二酯键

化学本

质

蛋白质

(三) “分子运输车”——载体

1.载体具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存；

②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段插入；

③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。

2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。

最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA 分子。

三．基因工程的基本过程

(一) 获得目的基因（目的基因的获取）

1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。

②用人工的方法合成。

★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。

★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

2.利用PCR 技术扩增目的基因

（1）PCR 的含义：是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。

（2）目的：获取大量的目的基因

（3）原理：DNA 双链复制

（4）过程：第一步：加热至90～95℃DNA 解链为单链；

第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA 结合；

第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA 聚合酶从引物起始进行互补链的合成。

（5）特点：指数形式扩增

(二) 制备重组 DNA 分子（基因表达载体的构建）

1.重组DNA 分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。

★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

2.方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA 连接酶把两者连接。

(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）

1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆菌转化法），其次还有基因枪

介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。

②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。

③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。

(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）

1.首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA 分子杂交技术。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。

第二节基因工程的应用

1.运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。

2.基因工程的应用

（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。

（3）基因诊断和基因治疗：

基因诊断：又称为DNA 诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。

基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。

实例：ADA 基因缺陷症的基因治疗

第三节蛋白质工程

1.蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，

甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。

2.蛋白质工程的基本原理

预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）→具有预期功能的蛋白质

3.蛋白质工程的应用

（1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。

（2）合成嵌合抗体。

（3）改变蛋白质的活性。

第二章细胞工程

第一节植物细胞工程

【基础梳理】

一、植物组织培养

1、植物细胞的全能性

（1）生物细胞的全能性

生物体细胞一般都是受精卵经有丝分裂形成，因而都含有生物一整套遗传物质，都具有发育成完整个体的潜能。但在生物体上有时不能表现出其全能性，只能通过分化形成不同的组织、器官，这是在特定的环境、激素等的影响下基因选择性表达的结果。

（2）植物细胞具有全能性的原因

植物体的全部体细胞都是从受精卵经过有丝分裂产生的，具有发育成完整个体所必需的全套遗传物质。

（3）细胞表现其全能性的条件

离体、无菌、一定的营养条件、植物激素诱导、环境条件（脱分化避光，再分化需光）。

（4）全能性的大小