生命大分子物质的制备优秀课件
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测定核酸\蛋白质的纯度:
DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
可见光光谱法
• 有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度 越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度， 可以测定溶液的浓度。
• 可见光光谱法是基于有色溶液对光的选择性吸收 而建立起来的一种分析方法。将待测物与相关试 剂或酶作用后的有色产物置于相应的可见光波长 下，即测定其消光值。
第一节 材料的选择与处理
一、材料的选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产 物。所选用的材料主要依据实验目的来确定。
选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、 成本低。
• 有效成分： 指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。
• 杂质： 有效成分以外的其他物质的统称。
例如：测定某一蛋白质溶液的浓度
方法：蛋白质与相关试剂（如双缩脲试剂）作用后 产生特定颜色的物质（紫色络合物），紫色络合 物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，于波长 540nm处进行比色测定。
最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶 液的浓度
荧光光谱法
利用有些生命大分 子物质自身可以吸 收特定光波的能量 后，发出荧光的特 性而建立的一种方 法。
简便、灵敏、准确、快速、专一
ห้องสมุดไป่ตู้
二、常用的测定方法
分析测定的方法主要有两类：
• 即生物学和物理化学的测定方法。
• 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋
白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性 同位素示踪法等；
物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相 色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光 光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
生命大分子物质的 制备
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天， 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究 是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能
的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有
能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题， 结构与功能的研究就无从谈起。
生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困 难的工作。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测 定更加快速、简便。
1、光谱法
• 不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定 的作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和 部分理化性质，这类测定方法为光谱法。
• 所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛 用于物质的含量测定。
• 紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法
紫外光谱法
利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质 而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液， 通过某一特定波长的紫外分光光度计，测定此溶 液的消光值即可换算出待测物的浓度。
1.测定核酸含量
2.测定蛋白质的含量及纯度
芳 香 族 氨 基 酸 的 紫 外 吸 收
测定核酸\蛋白质的含量:
OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
精确性 重复性 灵敏度 比吸收光谱法好
浊度法
主要用于悬浮液的测定。 测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。 不被吸收，主要是散射、反射。
（1）微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等
（2）菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷 冻保存；
对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备；
第二节 确立测定方法
一、目的与要求
• 生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极 微
• 测定方法应该：
③有效成分的抽提。
④粗品的纯化。 ⑤纯品的鉴定（纯度、量）。 ⑥产物的浓缩、干燥和保存。
首要了解生物大分子的理化性质：
①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的 稳定性。
③各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电 的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各 种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
例一：
胰岛素的提取 含量：牛胰腺 > 猪胰腺 来源：猪 > 牛 成本：牛 > 猪
综合结果：选用猪胰腺作为材料。
例二：
酸性磷酸酶分离纯化与活性测定
含量：小麦的胚芽中含量高
二、材料的处理
材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成 分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。
1、动物组织
必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料， 先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如 果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
④固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性 和对各种化学试剂的稳定性。
⑥对其他生物分子的特殊亲和力。
蛋白质的理化性质
•蛋白质的两性电离和等电点 •蛋白质的胶体性质 •蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固 •蛋白质的紫外吸收
•目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是 电泳、层析和离心三大技术。
⑷许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
⑸生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物，方法的通用性较差。
• 正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度
极大。
生物大分子制备的一般过程：
①根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和 处理合适的材料。
②确立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子 的关键。
生物大分子的制备有以下主要特点：
与化学产品的分离制备相比较：
⑴蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大导致分 离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。
⑵通常以复合物的形式存在，提取分离困难。
⑶许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活，因 此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取 制备最困难之处。
• 冰冻 -70℃保存备用较好
• 干燥
2、植物材料
必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物品种和生 长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很 大，另外与季节性关系密切。
如 叶片:直接洗净
植物种子:泡胀或粉碎
3、微生物：种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、 不受季节的影响，是常用的材料。
应注意它的生长期。在微生物的对数生长期，酶和 核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料 时有两种情况：
DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
可见光光谱法
• 有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度 越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度， 可以测定溶液的浓度。
• 可见光光谱法是基于有色溶液对光的选择性吸收 而建立起来的一种分析方法。将待测物与相关试 剂或酶作用后的有色产物置于相应的可见光波长 下，即测定其消光值。
第一节 材料的选择与处理
一、材料的选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产 物。所选用的材料主要依据实验目的来确定。
选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、 成本低。
• 有效成分： 指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。
• 杂质： 有效成分以外的其他物质的统称。
例如：测定某一蛋白质溶液的浓度
方法：蛋白质与相关试剂（如双缩脲试剂）作用后 产生特定颜色的物质（紫色络合物），紫色络合 物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，于波长 540nm处进行比色测定。
最后与标准品比对即可计算出该待测蛋白质溶 液的浓度
荧光光谱法
利用有些生命大分 子物质自身可以吸 收特定光波的能量 后，发出荧光的特 性而建立的一种方 法。
简便、灵敏、准确、快速、专一
ห้องสมุดไป่ตู้
二、常用的测定方法
分析测定的方法主要有两类：
• 即生物学和物理化学的测定方法。
• 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋
白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性 同位素示踪法等；
物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相 色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光 光度法）、电泳法、以及核磁共振等。
生命大分子物质的 制备
在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天， 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究 是探求生命奥秘的中心课题。生物大分子结构与功能
的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有
能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题， 结构与功能的研究就无从谈起。
生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困 难的工作。
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测 定更加快速、简便。
1、光谱法
• 不同的生命大分子物质与相应波长的光会发生特定 的作用，依据作用结果可推断出被测物质的含量和 部分理化性质，这类测定方法为光谱法。
• 所需的样品量少、操作简单、反应迅速、灵敏广泛 用于物质的含量测定。
• 紫外光谱法、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法
紫外光谱法
利用某些生物大分子具有吸收紫外光的性质 而建立的一种方法。将一定浓度的待测物溶液， 通过某一特定波长的紫外分光光度计，测定此溶 液的消光值即可换算出待测物的浓度。
1.测定核酸含量
2.测定蛋白质的含量及纯度
芳 香 族 氨 基 酸 的 紫 外 吸 收
测定核酸\蛋白质的含量:
OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
精确性 重复性 灵敏度 比吸收光谱法好
浊度法
主要用于悬浮液的测定。 测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。 不被吸收，主要是散射、反射。
（1）微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等
（2）菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等
另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷 冻保存；
对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备；
第二节 确立测定方法
一、目的与要求
• 生物大分子的两个重要特征：极易失活和含量极 微
• 测定方法应该：
③有效成分的抽提。
④粗品的纯化。 ⑤纯品的鉴定（纯度、量）。 ⑥产物的浓缩、干燥和保存。
首要了解生物大分子的理化性质：
①在水和各种有机溶剂中的溶解性。
②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的 稳定性。
③各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电 的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各 种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
例一：
胰岛素的提取 含量：牛胰腺 > 猪胰腺 来源：猪 > 牛 成本：牛 > 猪
综合结果：选用猪胰腺作为材料。
例二：
酸性磷酸酶分离纯化与活性测定
含量：小麦的胚芽中含量高
二、材料的处理
材料尽可能保持新鲜，尽快加工处理，以防有效成 分降解、破坏，必要时可冷冻、干燥处理。
1、动物组织
必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料， 先进行绞碎、脱脂等处理后在适当的溶剂中提取，如 果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。
④固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性 和对各种化学试剂的稳定性。
⑥对其他生物分子的特殊亲和力。
蛋白质的理化性质
•蛋白质的两性电离和等电点 •蛋白质的胶体性质 •蛋白质的变性、复性、沉淀和凝固 •蛋白质的紫外吸收
•目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是 电泳、层析和离心三大技术。
⑷许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
⑸生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物，方法的通用性较差。
• 正是这些特点致使蛋白质的分离纯化和分析的难度
极大。
生物大分子制备的一般过程：
①根据要制备的生物大分子的目的和要求，选择和 处理合适的材料。
②确立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子 的关键。
生物大分子的制备有以下主要特点：
与化学产品的分离制备相比较：
⑴蛋白质的组成、结构极其复杂，分子差异大导致分 离、纯化和鉴定有难度和特殊性；核酸较之要简单。
⑵通常以复合物的形式存在，提取分离困难。
⑶许多生物大分子离开了生物体环境就极易失活，因 此分离过程中如何防止其失活，是生物大分子提取 制备最困难之处。
• 冰冻 -70℃保存备用较好
• 干燥
2、植物材料
必须清洗,去壳，脱脂，并注意植物品种和生 长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很 大，另外与季节性关系密切。
如 叶片:直接洗净
植物种子:泡胀或粉碎
3、微生物：种类多，繁殖快、培养简便、易诱变、 不受季节的影响，是常用的材料。
应注意它的生长期。在微生物的对数生长期，酶和 核酸的含量较高，可以获得高产量。以微生物为材料 时有两种情况：