载体和质粒
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质粒及质粒载体复习题及答案一、填空题1、基因工程中有三种主要类型的载体：质粒DNA、病毒DNA、质粒和病毒DNA杂合体。
2.由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同。
SC DNA的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。
3.就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分：复制子（含有复制起点）、选择标记（主要是抗性基因）、克隆位点（便于外源DNA插入）。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
4.如果两个质粒不能稳定地共存于一个寄主细胞中，则属于同一个不亲和群，这是因为它们的复制机制相同所致。
5.质粒拷贝数是指细胞中质粒的份数同染色体的比值，即质粒/染色体。
6.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫质粒消除（或治愈）。
7.PBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于pMBl ,它的四环素抗性基因来自于pSClOl ,它的氨节青霉素抗性基因来自于PSE2124 （R质粒）。
8.YAC的最大容载能力是1000~2000kb , BAC载体的最大容载能力是300kb 。
9.把那些没有可检测表型的质粒称为隐蔽性质粒。
10.pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过PBR322和M13两种质粒改造而来。
它的复制子来自pMBl , Amp抗性基因则是来自转座子。
11・Ti质粒是自然界存在的植物基因工程的天然载体。
12.既能在夙coll又能在S・cerevisiae中自我复制的载体DNA称为穿梭载体。
二、选项题（单选或多选）1.下面关于松弛型质粒（relaxed plasmid）性质的描述中，（C ）是不正确的。
的制约, 而有较多的拷贝数A.质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制B.可以在氯霉素作用下进行扩增C.通常具有较少的拷贝数D.同严紧型质粒整合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子2.基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有（B ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体。
质粒载体
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段d P/E 启动子/增强子e Terms 终止信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
实验载体类型与质粒DNA的提取、分离和纯化
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Cosmid载体图谱
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细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome，BAC)
BAC是一些环状DNA分子。每个环状DNA分子中携带一个抗生 素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严紧型控 制的复制子，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶(repE)以 及 三 个 确 保 低 拷 贝 质 粒 精 确 分 配 至 子 代 细 胞 的 基 因 座 (para 、 parB和parC)。将外源基因组DNA片段在体外连接到约7kb的BAC 载体上，然后将连接物通过电穿孔的方法导入已鉴定好的大肠 杆菌重组缺陷型菌株，就构建成了单拷贝的质粒。
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质粒载体的基本特性和要求
1). 分子量小、多拷贝、松弛控制型
2) . 具有多种常用的限制性内切酶的单切点。 3) . 能插入较大的外源DNA片段 4) . 具有容易操作的检测表型。
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pBluescript SK(+/-)质粒载体（pBS）
基本结构: 1). ColE1 origin 2). Ampicillin 3). Fi origin 4). MCS (多克隆位点) 5). LacZ
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噬菌体（ phage）
噬菌体为一种侵染细菌的病毒,病毒 颗粒有一个包裹着48.5Kb的线性双链 DNA基因组的二十面体的头部,一个长 的柔韧的尾部.
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
三、质粒与载体
1.1 质粒的分子结构
通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；
也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 疏螺旋体、链霉菌和酵母菌
1.2 质粒的检测
提取所有胞内DNA后电镜观察；
超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察； 通常用碱裂解法提取质粒
1.3 质粒的命名
第1个字母(小写)： p， 质粒（plasmid）; 第2，文缩写; 编号（阿拉伯数字） ：区别同一类型的不同质粒 例： pUC18, pUC19
将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引 入原核细胞后,该重组DNA具有自主复制能力。
pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同
来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：
•来源于ColE1的衍生质粒pMB1 的DNA复制起点(ori) 及rop区；
•来源于质粒pSC101的四环素抗性基因(tetr)；
1.4 质粒的主要类型 质粒与宿主的关系：
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的； 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的
机能，从而使宿主得到生长优势。
（ P202）
质粒的主要类型
致育因子(Fertility factor，F因子)
质粒所编码 的功能和赋 予宿主的表 型效应 抗性因子(Resistance factor，R因子)
RNA Polymerase RNAII starts at -555 on H strand
- 555 RNAII
-445 - 555
Transcription beyond oriV Hybridisation at/near oriV
3’
-445 - 555
质粒载体
质粒载体简介质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。
它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。
如pBEU1、pBEU2。
插入失活型克隆载体。
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如pDF41、pDF42。
正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
质粒载体的筛选特征选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
载体
基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。
溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。
质粒与载体
质 质粒 粒与 与载 载体体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员一、质粒绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。
遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。
含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。
原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。
其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。
它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。
事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。
在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。
以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。
二、质粒的类型当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。
这些分型标准之间并无横向关联。
你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。
我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。
质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。
有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R质 粒(Rplasmids)。
载体
基因工程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够自主复制；有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点插入外源基因片段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分子较小，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件；载体的类型⏹质粒⏹噬菌体⏹其他载体(如:酵母人工染色体、细菌人工染色体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染色体外的小的双链闭合环状DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞⏹并不是所有的质粒都是环状分子, 在多种细菌中都发现有线性质粒⏹质粒广泛存在于原核生物中, 其大小从相对分子量小于1X106 到大于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作用下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作用下解旋。
溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作用溴化乙锭插入DNA超螺旋的作用随着插入的溴化乙锭数目增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直至产生环状分子的开放形式. 进一步的插入在双螺旋中引入了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋方向). 为了清楚起见,只表示了双螺旋的一条单链质粒DNA的复制类型⏹严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝⏹松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种生物体内复制的载体分子质粒的命名规则⏹小写字母p表示质粒（plasmid)⏹p后面的两个大写字母表示发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称⏹数字表示编号⏹例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围⏹质粒只编码少数几个其自身复制所需要的蛋白质,甚至在许多情况下只编码其中一个蛋白质⏹所有其他复制所需的蛋白,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的⏹质粒所编码的复制蛋白质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的一小部分区域是复制所必需的⏹因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进行⏹质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性⏹在没有选择压力的情况下，两种质粒不能共存于同一个宿主细胞内⏹如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒⏹显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本身复制和转移有关的基因外, 还携带一些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒⏹隐蔽质粒----无异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX⏹质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在高pH的碱性条件下，染色体DNA和蛋白质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的大部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染色体DNA复性，并聚集形成不可溶的网架。
2.1_基因工程载体-质粒载体_201209
死
抗菌素
活
b.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷 （IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。
LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
– 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员
• 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在 接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移， 这个过程由 bom 和mob 基因决定
（ 5）质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
根据宿主细胞所含的拷贝数多少， 可将质粒分成：
• 严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类 质粒为“严紧型”复制控制的质 粒(stringent plasmid)； 高拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中可高达10-200份拷贝，这类 质粒被称为“松弛型”复制控制 的质粒(relaxed plasmid)。
• 松弛型
（4）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过 细菌接合作用从一种宿主细胞内转移 到另外一种宿主内。
大肠杆菌接合（conjunction）
如：F质粒（性质粒、或F因子）
质粒迁移
• 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
– 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
基因工程载体质粒
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸 (fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒 载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培 养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。
人工质粒要素
1．质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题） 。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质 粒大于15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大， 拷贝数越低。
。
2．质粒应易于转化。 3．质粒应有较多的拷贝数。 4．选择标记。 5．质粒DNA可插入结合较大的外源DNA
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子
环形染色体DNA
质粒DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
• 复制子（reilcator） • 复制起始位点(replication origin site) • 多克隆位点（Polylink）(MCS) • 辅助序列(COS位点等) • 选择标记(LacZ,抗性等)
Merry，1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial
chromosome PAC, loannon，1994）、 10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial
chromosome，Farr，1991） 11,人类人工染色体（HAC，human artificial
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
• 质粒主要包括几个组成部分：
• 一、复制子（reilcator）
• 也就是基础复制子（basic replicon）， 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制 单位。一般约2kb，含一个复制起始部 位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有 控制复制的基因信息。
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
质粒和载体的关系
质粒和载体的关系
质粒是指在细胞质内具有自主复制能力的一类DNA分子，通常被用作基因克隆和基因表达等生物学实验中的载体。
载体是指能够携带外源DNA并进行转移、复制和表达的一类生物分子，其中质粒是最常用的一种载体。
质粒和载体的关系可以通过以下几点来说明：
1. 质粒是载体的一种形式。
质粒作为一种能够独立复制的DNA 分子，可以携带外源DNA序列，并被用作基因工程和遗传学实验中的载体。
在细胞内，质粒可以复制自身，同时也可以复制携带的外源DNA序列，从而实现基因表达等功能。
2. 载体可以是多种类型的分子。
除了质粒以外，还有病毒、贝壳蛋白、脂质体等分子可以作为载体。
不同类型的载体具有不同的特点和应用范围，但质粒作为一种常用的载体，因其构建简单、易于操作等特点，被广泛应用于生物学实验。
3. 质粒和载体的选择取决于实验需求。
在进行基因克隆和基因表达等实验中，研究人员需要根据实验所需的外源DNA序列大小、表达强度、转染效率等因素，选择适用的质粒载体。
同时，还需要考虑质粒在目标细胞中的稳定性、毒性等因素，以确保实验结果的准确性和可重复性。
综上所述，质粒是载体的一种形式，作为常用的载体之一，广泛应用于生物学实验中。
质粒和载体的选择应根据实验需求进行，以确保实验结果的准确性和可重复性。
第三章载体ppt课件
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的
载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源
DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（2）长度: 约2.7kb （3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的
5’端。
（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的肽 互补（蓝白斑）相结合。
蓝白斑选择原理： ① Xgal ② -半乳糖苷酶Xgal显色反应：-半乳糖苷
酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一 个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的肽互补
加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内 部。如pDF41、pDF42、pBR329。
（5） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的 性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大 肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆 菌的转录—翻译信号控制之下。
六、其它质粒载体
1. pGEM-3Z
由pUC派生而来。与pUC的主要区别是 在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子 T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识 别转录。
2. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）
（1）穿梭质粒载体的结构
人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体。
1）-肽（ lacZ’ ）： -半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨
载体
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
P
O
Z
Y
X
诱导物
乳糖
P O
Z
Y
X
Am
lacZ
N2H
COOH
片段
片段
lacZ
标志补救（ß -半乳糖苷酶法）
Lac Z
X-gal
λ噬菌体载体的构建
构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制 位点的删除。 野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种 限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、 NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶 各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切 点在λ增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌 体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载 体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作 为载体的噬菌体λ都短于野生型。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
质粒的类型
F质粒 F因子
能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不 存在该质粒的细胞中
R质粒 抗药性因子
编码一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将这 种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞，使后者也获 得同样的抗菌素抗性能力
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。 可见其原型质粒在使用上有优点。
较小的分子量 两种抗菌素抗性标记 较高的拷贝数 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生
的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分
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克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔
5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。
1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（ector）。
2. 载体的分类
按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle ector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制。