质粒载体基础
质粒载体的操作和cDNA文库的构建
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
质粒载体
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段d P/E 启动子/增强子e Terms 终止信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
基因工程-载体
常用的质粒载体 pUC系列
University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造 而成。属正选择载体。如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。 1、元件来源 复制起点ori---pBR322的 ori Ampr 基因---pBR322的Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ’基因） 多克隆位点（MCS）区段---位于lacZ’基因 中的靠近5`-端。 2、长度 约2.7kb
Apr转化子 Tcr转化子
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 ApS Tcr为重组子
Apr Tcr为原载体
即为非重组子
Ampr
1)限 制 酶 切 2)DNA重 组
无 DNA插 入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有 DNA插 入 外 源 DNA
Ampr Tcs Ampr Tcs
2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息， 但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一
个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合 基因工程的安全要求。
大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠 杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数 量的作用。 大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1 。
第一节 质粒载体
质粒（plasmid）：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
质粒载体的构建
四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是 16 度数个小时或者过夜，或者 4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议 4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用 PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入 4 度冰箱即可。我用的 TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、 通过电泳，粗略判定质粒和 DNA 的浓度比例。一般加入连接液的 DNA:质粒＝9：1 2、 放入质粒和 DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。
质粒载体的构建－菜鸟入门手册
dongkey 制作
本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择 CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是 PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据 CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行 PCR。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化 PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的 BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找 NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是 TAKARA。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是 37 度。 菜鸟体贴提示： 1、 确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是 DNA＋BUFFER＋
质粒载体
质粒载体简介质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
人工构建的质粒载体分类高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。
适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。
低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。
它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。
失控的质粒载体这是一类温度敏感型复制控制质粒。
如pBEU1、pBEU2。
插入失活型克隆载体。
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
如pDF41、pDF42。
正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
质粒载体的筛选特征选择质粒载体的要素是要了解可用到的载体的特征和预测重组克隆所用于的实验。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
质粒与载体
质 质粒 粒与 与载 载体体 中央研究院 植物研究所 杜 镇 研究员一、质粒绝大多数的生物都是以 DNA 的形式来储藏其遗传信息。
遗传物质要能生生不息地传给后代 的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication ，或译为复制起点)，使整 个基因体得以复制。
含有复制原的遗传物质称为 replicon ，我们姑且把它译为为复制体吧！。
原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。
其中 质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼 DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。
它们的 基因体约由 2,000 至 150,000 个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如 Borrelia burgdorfferi)。
事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。
在自然环境中它们相 当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌 (Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌 (Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。
以下我们谈的以细菌性质粒为主，尤其是革兰氏阴 性菌的质粒。
二、质粒的类型当我们谈到质粒的类型时，就要看你从哪个角度来看它们，譬如说抗药性、结合生殖能力、 宿主范围及 DNA 复制方式等等。
这些分型标准之间并无横向关联。
你无法说能结合生殖的 质粒一定抗药或不抗药，也无法确定宿主范围和质粒套数的调控有何关联。
我们用到这些名 词时，只是对特定质粒的性状做一些描述而已。
质粒的真正系统分类标准并非靠些性状，而 是依据它们的不共容性(incompatibility)。
有的质粒带有显著特征可供我们侦测它们的存在，无已知特征的质粒称为隐性质粒(cryptic plasmids)；有特征者称为显性质粒(acryptic plasmids)；带有抗药基因的天然质粒称为 R质 粒(Rplasmids)。
基因工程载体--质粒
• F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形 因子是雄性决定因子， 因子是雄性决定因子 成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使 成一种叫做性须（ ） 的结果， 经性须进入F 细胞。 细胞则变为F 细胞。 F+经性须进入 -细胞。F-细胞则变为 +细胞。 F因子可以通过接合作用自我转移，也能够 因子可以通过接合作用自我转移， 因子可以通过接合作用自我转移 带动寄主染色体一道转移。 F因子的这种 带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种 整合过程是可逆的。在一定条件下， 细 整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细 胞又可重新变为F+或F-细胞。 胞又可重新变为 细胞。 • 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全 基因工程多选用非接合型质粒， 角度考虑
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子 环形质粒分子
环形染色体DNA 环形染色体DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
质粒DNA 质粒
控制质粒DNA转移的基因 控制质粒DNA转移的基因 质粒DNA
质粒主要包括几个组成部分
• • • • • 复制子（ 复制子（reilcator） ） 复制起始位点(replication origin site) 复制起始位点 多克隆位点（ 多克隆位点（Polylink）(MCS) ） 辅助序列(COS位点等 位点等) 辅助序列 位点等 选择标记(LacZ,抗性等 抗性等) 选择标记 抗性等
基 因 工 程 载体
南 京 农 业 大 学
陈 溥 言
概
述
基因工程是利用酶学方法将不同来源的 DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插 或 ，在体外切割、修饰、 入到不同目的的基因工程载体中，进行扩 入到不同目的的基因工程载体中， 增和表达，研究基因结构和功能， 增和表达，研究基因结构和功能，基因和 蛋白质关系的一种分子生物学技术。 蛋白质关系的一种分子生物学技术。
第三章质粒载体
质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
4、质粒DAN的复制类型
严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称 “严紧型”复制控制的质粒。
松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝， 称“松弛型”复制控制的质粒。
质粒拷贝数：每个细菌染色体平均具有的质粒DNA 分子的数目。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受 自身的制约，还受寄主的控制。
6、质粒的其他特性
稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区 重组性：质粒间、质粒同染色体间重组 消除和恢复性等特性
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
2、质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
分离纯化质粒DNA的程序
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
质粒载体概述及提取
质粒载体的概述及提取生物技术112班第2学习小组姓名：鲍臻学号：2011013410本次研讨方向：质粒载体的概述及提取方法介绍质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。
自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒所携带的特征的改变。
大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。
质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。
质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。
质粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。
一些质粒在菌种间可自由地转移它们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。
质粒带有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。
目前提取质粒DNA的方法有两种：煮沸法和碱变性抽提法，而决定用哪种方法是根据质粒载体的特征来决定的。
包括:质粒载体的大小，宿主大肠杆菌的菌株特性及纯化质粒DNA方法。
目前各实验室最常用的质粒DNA提取方法。
提取原理主要是根据细菌染色体DNA分子比质粒DNA分子大得多，也复杂得多，所以染色体DNA和质粒DNA的变性和复性过程有较大差异，从而达到分离目的。
在pH12的碱性条件下，线性染色体DNA和蛋白质变性充分。
质粒DNA大部分氢链也断裂变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。
当用pH4.8的KAc的高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA容易恢复到原来的构型，溶解在溶液中，而染色体DNA不能完全恢复原构型，而形成缠连的网状结构。
2.1_基因工程载体-质粒载体_201209
死
抗菌素
活
b.蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）
乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷 （IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。
LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
-半乳糖苷酶Xgal显色反应： -半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的 物质5-溴-4-氯靛蓝。 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
– 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员
• 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在 接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移， 这个过程由 bom 和mob 基因决定
（ 5）质粒DNA的构型：
SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）
根据宿主细胞所含的拷贝数多少， 可将质粒分成：
• 严紧型
低拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中仅含有1-2份的拷贝，称这类 质粒为“严紧型”复制控制的质 粒(stringent plasmid)； 高拷贝数的质粒，每个宿主细 胞中可高达10-200份拷贝，这类 质粒被称为“松弛型”复制控制 的质粒(relaxed plasmid)。
• 松弛型
（4）可转移性
在天然条件下，大多质粒可通过 细菌接合作用从一种宿主细胞内转移 到另外一种宿主内。
大肠杆菌接合（conjunction）
如：F质粒（性质粒、或F因子）
质粒迁移
• 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
– 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
第四章(质粒载体)解析
1．氯化铯密度梯度离心法
• 2．碱变性法
• 3．微量碱变性法
• 4．影响质粒DNA产量的因素 • • (1) 寄主菌株的遗传背景 (2) 质粒的拷贝数及分子大小
分离纯化质粒 DNA的程序
寄主菌株的遗传背景
• 使用endA基因发生突变的(endAl)大肠杆 菌寄主菌株，
pUCl8及PUCl9质粒载体的形体图
丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形体图
5．其它重要的质粒载体
• • • • (1)丧失迁移功能的质粒载体 拥有较高水平的拷贝数 失去了bom位点，即便在共存的F质粒提 供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作 用。 • (2)能在体外转录克隆基因的质粒载体
• 定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立 于染色体外的自我复制并稳定遗传的环 状双链DNA分子。 • 命名：小写字母p代表质粒，两个大写 字母代表发明者，后接实验编号， • 分类： • 分布：
1）根据质粒的性状特征
①F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 ②R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，
大肠杆菌F因子基因图
(3)质粒DNA的接合转移机制
• ①细胞交配对的形成： 大肠杆菌F质粒编 码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立 配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它 至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。 ②质粒DNA的转移F质粒DNA的转移是从 转移起点oriT开始的。
•
•
endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去
了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力， 增进了质粒DNA分子的稳定性。
第二节 质粒DNA的复制与 拷贝数的控制
农杆菌载体——Ti质粒的基本知识
农杆菌载体——Ti质粒的基本知识农杆菌质粒载体系统质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti 质粒和 Ri 质粒。
Ti质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri 质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。
Ti 质粒和Ri 质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。
但实际工作中，绝大部分采用 Ti 质粒。
在这里小编也是给大家着重介绍一下Ti质粒的基本知识。
T-DNA区和Vir区农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移和整合的天然系统。
Ti 质粒有两个区域：①T-DNA 区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）②Vir 区（编码能够实现 T-DNA 转移的蛋白）。
其中，T-DNA 长度为 12-24kb 之间，两端各有一个含 25hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的 T-DNA 可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对 DNA 的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA 并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。
从而将外源基因导入到宿主的基因组中。
Ti质粒的结构Ti 质粒(Tumor induced Plasmid) 是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95--156x106 D，约有150-200kb。
依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti 质粒可以分为四种类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型或琥珀碱型。
毒性区（vir区）：激活T-DNA的转移T-DNA区：侵染植物时，从Ti 质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成有关的基因。
接合转移区：存在与细菌间进行接合有关的基因复制起始区：保证Ti 质粒进行自我复制编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。
质粒载体的概况及构建
特性
稳定性
质粒载体可以在宿主细胞内稳 定存在，不易丢失或发生突变
。
可复制性
质粒载体可以在宿主细胞内自 主复制，扩增DNA分子。
可选择性
质粒载体通常携带抗性基因， 可以通过抗生素筛选和富集。
可修饰性
质粒载体可以通过限制性酶切 和连接等分子生物学技术进行
修饰和改造。
质粒载体的应用领域
克隆技术
质粒载体是基因克隆和DN择
天然质粒载体
01
存在于生物体内的天然质粒，具有自我复制能力，可在宿主 细胞内稳定存在。
02
天然质粒通常具有抗生素抗性基因，可作为筛选标记基因。
03
天然质粒载体的复制能力有限，拷贝数较低，且容易丢失。
人工构建的质粒载体
通过基因工程技术人工构建的质粒载体，具有特 定的复制起始位点和筛选标记基因。
转化与筛选
转化
将连接产物导入受体细胞中，常用的受体细胞有细菌、酵母、动物细胞等。
筛选
通过抗性筛选、PCR鉴定等方法对转化子进行筛选，获得阳性克隆。
04
质粒载体的改造与
优化
启动子的优化
选择合适的启动子
启动子突变
根据基因的表达需求，选择合适的启 动子，如强启动子、弱启动子等。
通过突变启动子序列，改变其转录活 性，以实现基因表达的调控。
功能元件
选择含有合适功能元件的质粒载体，如启动 子、多克隆位点等，以满足实验需求。
稳定性
选择稳定性好、不易丢失的质粒载体，以确 保目的基因在宿主细胞内的稳定表达。
03
质粒载体的构建过
程
目的基因的获取与鉴的基因。
目的基因的鉴定
通过测序、限制性酶切、PCR扩 增等手段对目的基因进行鉴定， 确保其准确性。
质粒载体介绍(质粒基本特性和种类及标记基因)
质粒载体介绍（质粒基本特性和种类及标记基因）2010-01-25 13:25:29 来源：易生物实验浏览次数：6084 网友评论 0 条一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类关键词：质粒载体质粒载体标记基因一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
图3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前 RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的 RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。
形成的 RNAⅠ可控制 RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强 RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。
削弱 RNAⅠ和 RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图 3-1 带 pMB1（或 ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数质粒 复制子 拷贝数pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20pUC 系列质粒及其衍生质突变的 pMB1 500～700粒pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～212pSC101 及其衍生质粒 pSC101 ～5ColE1 ColE1 15～20pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。
pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和danZ 的产物。
质粒载体介绍
目录
质粒载体概念
质粒载体性质
几种质粒介绍
何为质粒载体？
• 质粒载体是是一类小 型闭合环状核外双螺 旋DNA分子，能独立于 细胞核进行自主复制。 约2~100×106Dalton， 上面携带有数个到数 十个甚至上百个基因。
返回目录
质粒载体的性质
• ①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以 通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在； • ②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可 把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复 制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只 有少数几个（1~5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在 染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以 达到10~200个或更多的。 • 可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌 细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以 单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可 成为基因工程的载体。
返回目录
Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.
返回目录
几种代表性质粒
• 1. F–因子（fertility factor）：又称致育因 子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相 当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足 以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因 （tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌 属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、 链球菌等细菌中，决定性别。
载体
乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物
P
O
Z
Y
X
诱导物
乳糖
P O
Z
Y
X
Am
lacZ
N2H
COOH
片段
片段
lacZ
标志补救（ß -半乳糖苷酶法）
Lac Z
X-gal
λ噬菌体载体的构建
构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制 位点的删除。 野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种 限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、 NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶 各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切 点在λ增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌 体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载 体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作 为载体的噬菌体λ都短于野生型。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
质粒的类型
F质粒 F因子
能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不 存在该质粒的细胞中
R质粒 抗药性因子
编码一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将这 种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞，使后者也获 得同样的抗菌素抗性能力
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。 可见其原型质粒在使用上有优点。
较小的分子量 两种抗菌素抗性标记 较高的拷贝数 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生
的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第一节质粒载体一、质粒的基本特性1．质粒的复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和θ复制。
在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1 质粒或ColE1 质粒的复制起始位点。
图3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与DNA 形成杂交体；而后RNase H 切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。
形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop 增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。
削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图3-1 带pMB1（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。
2．质粒的拷贝数质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
表5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表3-1 ：质粒载体及其拷贝数pUC 系列质粒的复制单位来自质粒pMB1 ，但其拷贝数较高。
pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶Ⅰ，DNA 聚合酶Ⅲ），依赖于DNA 的RNA 聚合酶，以及宿主基因dnaB 、dnaC 、dnaD 和danZ 的产物。
因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1（或ColE1）复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2～3 千个质粒。
3．质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
在大肠杆菌中现已发现30 多个不相容群，如ColE1 和pMB1 ，pSC101 和p15A。
4．转移性质粒具转移性。
它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因mob，转移基因tra ，顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic。
二、标记基因按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。
选择标记用于鉴别目标DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来，筛选标记可用于将特殊表型的重组子挑选出来。
（一）选择标记抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。
1．氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, amp r）氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。
青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。
氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。
青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链R-CO- 和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。
在6-APA 中有一个饱和的噻唑环（A）和一个β-内酰胺环，6-APA 为由L- 半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽。
2．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tet r）四环素可与核糖体30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。
四环素抗性基因编码一个由399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。
3．氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cm r, cat）氯霉素可与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。
目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性P1 噬菌体（也携带Tn9）。
cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基23kDa）。
在乙酰辅酶A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。
4．卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kan r, neo r）卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。
卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3'）-Ⅱ, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。
在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。
5．琥珀突变抑制基因supF在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG），或乳白突变（突变为UGA）。
supF 基因编码细菌的抑制性tRNA ，可在UAG 密码子上编译酪氨酸。
如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr 基因和ampr 基因，只有当宿主含有supF 基因时才会对Amp 和Tet 具有抗性。
相应的，supE 基因在UAG 密码子上编译谷氨酰氨。
由于目前所用的标记基因使用方便，因此用这类标记的载体较少。
6．其它还有一些正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。
如蔗糖致死基因SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。
在含蔗糖的培养基上sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。
（二）筛选标记筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。
1．α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。
大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。
例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41 个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。
对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。
但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。
在lacZ' 编码区上游插入一小段DNA 片段（如51 个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。
但是，若在该DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无α-互补能力的β-半乳糖苷酶片段。
利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。
在相应的载体系统中，lacZ△M15 放在F 质粒上, 随宿主传代；lacZ' 放在载体上, 作为筛选标记（图3-2）。
相应的受体菌有JM 系列、TG1 和XL1-Blue ，前二者均带有D （lac - proAB）F'[ proAB + lac Iq lacZ D M15] 基因型。
其中lac I 为lac 阻抑物的编码基因，lac Iq 突变使阻抑物产量增加，防止lacZ 基因渗漏表达。
lacZ 基因是乳糖lac操纵子中编码β-半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。
乳糖既是lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。
异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。
底物X-gal 还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。
2．插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（amp r）两种抗性标记。
当外源DNA 片段插入tet r 基因后，导致tet r 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。
这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
三、质粒载体的种类（一）克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体。
1．pBR322pBR322 质粒的大小为4361bp ，GenBank 注册号为V0lll9 和J01749 ，含有30 多个单一位点，具有四环素抗性基因（tet r）和氨苄青霉素抗性基因（amp r），其质粒复制区来自pMB1 （如图3-3）。
目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。
利用四环素抗性基因内部的Bam HⅠ位点来插入外源DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。
2．pUC18 和pUC19pUC18 和pUC19 大小只有2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA 片段，GenBank注册号为L08752（pUC18）和X02514（pUC19）。
由pBR322 改造而来，其中lacZ （MSC）来自M13mp18/19 图3-4 是其质粒图谱。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。
这些质粒缺乏控制拷贝数的rop 基因，因此其拷贝数达500-700 。
pUC 系列载体含有一段lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。
因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
图3-4 ：pUC18/19 质粒图谱3．pUC118 和pUC 119由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为3162bp ，GenBank 注册号为U07649（pUC118）和U07650（pUC119）。
相当于在pUC18/19 中增加了带有M13 噬菌体DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
4．pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z/4Z由pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大小为2.74kb, GenBank 注册号为X65304（pGEM-3Z, 2743bp）和X65305（pGEM-4Z, 2746）。