木聚糖酶检测方法
饲料中木聚糖酶活性测定_(1)
东莞泛亚太生物科技有限公司研发方案一、实验目的：测定颗粒饲料中木聚糖酶活性，考察饲料调质制粒过程中对木聚糖酶活性的影响。
二、试验方案⒈、饲料中木聚糖酶活性标准曲线的制作[1]根据饲料中添加木聚糖酶含量，配制梯度浓度木酶的标准酶液A；[2]空白饲料样品：从饲料厂取粉碎粒度均匀的适量未加酶制剂饲料样品，包括粉料和颗粒料，分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[3]空白饲料样品加酶后处理：称取7 份空白饲料样品，先粉碎，（约3～4g，须预实验进一步确定保证其吸光度在0.300左右），然后加入木酶缓冲液振荡混合15min，然后依次加入6份不同体积的酶液A（其中一份饲料原料不加入酶液A），定容，摇匀，离心得到上清酶液；[4]空白饲料样品及加酶后样品的还原糖含量OD540值测定：参照APAC实验室木酶检测方法，测定[3]中上清液的OD吸光值；540[5]标准曲线的绘制：以OD540值为横坐标,以0.2ml上清液中所含木聚糖酶活力（U/g）为纵坐标Y，绘制OD 值-酶活梯度曲线。
空白：以0.20ml缓冲液替代0.2ml上清液，其它操作步骤同上。
⒉调质制粒饲料中木聚糖酶活性的测定[1]制备木聚糖酶单酶样品30000U/g，运用APAC实验室检测方法先测定木聚糖酶酶活；[2]在饲料中添加200g木聚糖酶样品，样品用玉米粉(40目)逐级稀释至20kg，再与其他原料混合（因此，要求预混料中没有酶制剂，这步骤要与兴业协商），并且饲料配方组成及原料要最大程度与上述1[2]的空白饲料样品一致；[3]分别在调质前进料口（未接触蒸汽）、调质出口和制粒后的颗粒料取样，每个点取样本数不低于4个，且取样时间都控制在饲料混合均匀的中间阶段；[4]称取3中的加酶饲料（添加木聚糖酶），先粉碎，加入木酶缓冲液定容、振荡15min、离心取上清。
随后参照标准曲线制作方法测其吸光值，并根据标准曲线计算得出其酶活；[5]根据不样品的酶活性结果计算调质、制粒过程中对酶活性的损失率。
木聚糖酶检测方法
木聚糖酶检测方法
木聚糖酶是一种能够水解木聚糖为单糖的酶类。
木聚糖是构成植物细胞壁的重要成分，因此木聚糖酶在生物质转化、纸浆制造、饲料工业等领域具有重要的应用价值。
木聚糖酶检测方法主要有两种：基于底物的检测方法和基于抗体的检测方法。
基于底物的检测方法包括荧光素酮底物法、4-nitrophenyl-β
-D-木聚糖苷酸盐法、3,5-dinitrosalicylic acid法等。
这些方法利用底物与酶的反应产生可测定的信号，从而检测酶的活性。
基于抗体的检测方法是将制备好的抗体与木聚糖酶结合，形成免疫复合物，利用特定的检测方法检测抗体与酶的结合情况。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和不需要底物等优点。
总的来说，木聚糖酶检测方法的选择应根据具体情况进行考虑，以达到最佳检测效果。
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木聚糖酶活力测定
木聚糖酶活力测定原理：木聚糖是植物半纤维素的主要成分，为自然界中广泛存在、含量仅次于纤维素的可再生多糖资源，占细胞干重的7％一35％。
木聚糖酶是一类可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的复合酶系。
它以内切方式降解木聚糖主链架的β—l，4-木糖苷键,其水解产物主要是木二糖和木寡糖，少量的木糖和阿拉伯糖。
木聚糖酶水解木聚糖底物生成的还原性糖，可在煮沸条件下与DNS显色剂生成棕红色的氨基化合物.在一定范围内，还原糖的生成量与反应液的颜色强度成正比。
因此可通过测定棕红色的氨基化合物540nm波长下吸光度来测定木聚糖酶活力。
试剂:DNS溶液：酒石酸钾钠182 g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5—二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，苯酚5 g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL,贮于棕色瓶中，室温保存.1mg/mL木糖标准溶液:无水木糖于80 °C烘至恒重,称取0.1 g于烧杯中,加适量蒸馏水溶解,转入容量瓶中并定容至100 mL。
方法：标准曲线的绘制:取6支20mL的试管按下表顺序依次加入各试剂沸水中煮沸5min，流水冷却2min，各管中加16。
5 mL蒸馏水，定容到20mL，摇匀，放置20min后，测定540nm处吸光度.待测液木聚糖酶活力的测定待测样品空白对照1。
加底物1％的木聚糖溶液4 mL 1. 加酶液1 mL2.50 °C预热3 min 2. 沸水煮沸10 min3。
加酶液1 mL 3。
加底物1％的木聚糖溶液4 mL 4.混合 4. 混合5。
50 °C水解10 min 5。
50 °C水解10 min6。
加DNS试剂2 mL 6。
加DNS试剂2 mL7.混合7.混合8。
沸水浴中10 min 8。
沸水浴中10 min9。
冷却定容至20 mL 9.冷却定容至20 mL10.样品540 nm下测定10。
样品540 nm下测定。
添加在饲料中木聚糖酶的测定方法[发明专利]
![添加在饲料中木聚糖酶的测定方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/557b5f0d998fcc22bdd10d45.png)
专利名称：添加在饲料中木聚糖酶的测定方法
专利类型：发明专利
发明人：崔细鹏,彭宇,邹嘉豪,李阳源,柴毛毛,周银华申请号：CN202010126314.1
申请日：20200228
公开号：CN111269958A
公开日：
20200612
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：发明涉及饲料领域，具体涉及添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。
该方法将待测饲料样品预冷经乙酸缓冲液透析，然后测定酶活。
本发明所述添加在饲料中木聚糖酶的微量测定方法通过饲料样品的预处理，避免了木聚糖酶在提取过程中失活，降低了木聚糖酶检测下限，消除了干扰背景的影响，因此能够准确测定添加在饲料中木聚糖酶含量。
申请人：广东溢多利生物科技股份有限公司
地址：519060 广东省珠海市南屏科技工业园屏北一路8号
国籍：CN
代理机构：北京法信智言知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：刘静荣
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木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定
木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定2000级生物技术专业，翁杰、张弢木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase E.C.3.2.1.8)是一类以内切方式专一性水解木聚糖分子中β-1,4-糖苷键的酶，其水解产物主要是木二糖和木寡糖。
很多细菌和真菌都可以产生木聚糖酶，有些木聚糖酶已被分离纯化并对其进行了性质研究，木聚糖酶基因也已被克隆和表达。
自七十年代末，八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。
一般都是以传统的方法：提取染色体法制备感受态细胞或电转化法转化受体细胞大肠杆菌，从转化子中筛选出阳性克隆。
以下是木聚糖酶和木聚糖酶基因xynA的序列endo-1,4-beta-xylanaseLength:213aa,molecular weight:23345Da,CRC64 check sum:20CBA35238CC0564 MFKFKKNFL V GLSAALMSIS LFSA TASAAS TDYWQNWTDG GGIVNA VNGS GGNYSVNWSN TGNFVVGKGW TTGSPFRTIN YNAGVW APNG NGYL TL YGWT RSPLIEYYVV DSWGTYRPTG TYKGTVKSDG GTYDIYTTTR YNAPSIDGDR TTFTQYWSVR QSKRPTGSNA TITFSNHVNA WKSHGMNLGS NW AYQVMA TE GYQSSGSSNV TVW 213Bacillus subtilis endo-1,4-beta-xylanase gene,complete cds 702bp DNABASE COUNT 207a 123c 182g 190tORIGIN1 tacctcaaag tcggaaaaaa tattatagga ggtaacatat gtttaagttt aaaaagaatt61 tcttagttgg attatcggca gctttaatga gtattagctt gttttcggca accgcctctg121 cagctagcac agactactgg caaaattgga ctgatggggg cggtatagta aacgctgtca181 atgggtctgg cgggaattac agtgttaatt ggtctaatac cggaaatttc gttgttggta241 aaggttggac tacaggttcg ccatttagga cgataaacta taatgccgga gtttgggcgc301 cgaatggcaa tgggtatttg actttgtatg gctggacgag atcgcccctc atagaatatt361 atgtggtgga ttcatggggt acttataggc ctaccggaac gtataaaggt actgtaaaga421 gtgatggggg tacatatgac atatatacaa ctacacgtta taacgcacct tccattgatg481 gcgatcgcac tacttttacg cagtactgta gtgttcgcca gacgaagaga ccaactggaa541 gcaacgctac aatcactttc agcaatcag tggacgcatg gaagagccat ggaatgaatc601 tgggcagtaa ttgggcttac caagtcatgg cgacagaagg atatcaaagt agtggaagtt661 ctaacgtaac agtgtggtaa cagatcatcc ttaatcaggg gt实验步骤一，培养Bacillus subtilis培养基NUA二，细菌基因组DNA的提取材料：TE缓冲液，10%SDS，20mg/ml蛋白酶K，5mol/L NaCl,CTAB/NaCl溶液，24:1氯仿/异戊醇，25:24:1酚/氯仿/异戊醇，异戊醇，70%乙醇步骤：1，培养5ml细菌培养物至饱和，取1.5ml培养物离心2min2，沉淀物加567μl的TE缓冲液重悬。
木聚糖酶测定方法
木聚糖酶测定方法引言木聚糖酶是一种重要的酶类，它能够分解木聚糖为较小的糖分子，从而在生物质转化、纸浆漂白等工业过程中发挥关键作用。
因此，准确测定木聚糖酶活性和浓度对于优化生物质转化过程以及改进纸浆漂白工艺具有重要意义。
本文将介绍一种木聚糖酶测定方法，分析其原理、步骤和应用。
原理木聚糖酶测定方法基于其对于木聚糖的降解作用，通过测定产生的还原糖的量来反映其活性或浓度。
其中，还原糖可以通过氧化还原反应与染料发生反应产生有色产物，再利用光度计测量其吸光度来计算酶活性或浓度。
步骤木聚糖酶测定方法包括样品处理、反应体系构建、测定产物的光度测量等步骤。
样品处理首先，从待测样品中提取木聚糖酶。
样品可以是纯净的酶制剂，也可以是经过适当处理纸浆、生物质等来源的样品。
提取方法可以通过离心、超声波处理、化学溶解等手段进行。
提取后，需要对提取物进行适当的稀释，以使测定结果在测量范围内。
反应体系构建接下来，根据实验需求和样品特点，构建适合的反应体系。
一般情况下，反应体系包括适当的缓冲液、底物溶液和酶提取物。
缓冲液选择应根据酶的最适工作pH进行选择，以维持最佳酶活性。
底物溶液则需要根据酶的底物特异性选择相应的木聚糖衍生物。
酶活性测定将构建好的反应体系预先恒温至合适的温度，然后加入木聚糖酶提取物开始反应。
反应时间一般为15-30分钟。
在反应结束后，通过加入染料溶液来停止反应，并将反应产物转化为有色产物。
光度测量将带有有色产物的溶液放入光度计中，并设置合适的波长进行测量。
利用与标准品的吸光度测量结果对比计算酶活性或浓度。
应用木聚糖酶测定方法广泛应用于生物质转化、纸浆漂白等领域，具体应用包括：1.生物质转化：通过测定木聚糖酶的活性或浓度，可以评估其在生物质转化过程中的效果，并指导酶剂的添加和反应条件的优化。
2.纸浆漂白：木聚糖酶能够去除纸浆中的木聚糖，从而减少有害离子的生成，改善纸浆漂白的效果。
测定木聚糖酶的浓度可以指导纸浆漂白工艺的改进。
木聚糖酶测定方法
木聚糖酶测定方法引言：木聚糖是一种常见的多糖，广泛存在于植物细胞壁中。
了解木聚糖的含量和分布对于研究植物细胞壁的结构和功能具有重要意义。
而木聚糖酶是一种用于测定木聚糖含量的酶类。
本文将介绍木聚糖酶测定方法的原理、步骤和应用。
一、原理木聚糖酶是一种特异性降解木聚糖的酶，它能够将木聚糖水解成木糖单体。
测定木聚糖酶的活性可以间接反映出样品中木聚糖的含量。
木聚糖酶测定方法的原理是通过测定酶解反应中产生的还原糖（如葡萄糖）的含量来确定木聚糖的含量。
二、步骤1. 样品制备：将待测样品（如植物细胞壁提取物）进行适当处理，使其达到适合酶解反应的条件。
通常可以通过酸或酶的预处理来实现。
2. 酶解反应：将处理后的样品与木聚糖酶溶液混合，经过一定时间的反应，使木聚糖被酶水解成还原糖。
3. 反应停止：加入适当的反应停止剂，如硫酸或硼酸，使酶活性完全失活，停止酶解反应。
4. 还原糖测定：采用合适的还原糖测定方法，如酚硫酸法或安培法，测定反应体系中还原糖的含量。
5. 含量计算：根据还原糖的测定结果，结合标准曲线，计算出样品中木聚糖的含量。
三、应用木聚糖酶测定方法在植物学、生物化学和生物工程等领域具有广泛的应用价值。
以下是一些常见的应用：1. 生物燃料研究：木聚糖是植物细胞壁的主要组分之一，其降解可以提供可再生的生物燃料。
通过测定木聚糖酶的活性，可以评估植物材料中木聚糖的含量，进而指导生物燃料的生产和利用。
2. 食品工业：木聚糖是一种常见的食品添加剂，用于增加食品的纤维含量和改善口感。
通过测定木聚糖酶的活性，可以监测食品中木聚糖的含量，确保产品质量。
3. 植物生长调控研究：木聚糖在植物生长和发育过程中起着重要的作用。
通过测定木聚糖酶的活性，可以研究木聚糖的合成和降解过程，进一步揭示木聚糖在植物生长调控中的功能机制。
结论：木聚糖酶测定方法是一种重要的技术手段，用于测定样品中木聚糖的含量。
通过测定酶解反应中产生的还原糖的含量，可以间接反映出样品中木聚糖的含量。
酸性木聚糖酶检验操作规程
木聚糖酶检验操作规程1酶活定义在50℃，pH4.80酸性条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的燕麦木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU），还原糖以木糖等量。
2原理在一定温度和pH条件下，木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖和单糖。
具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的强度与酶解产生还原糖的量成正比，还原糖生成量与反应液中木聚酶活力成正比，通过分光比色测定反应液吸光度，可计算木聚酶活力。
3仪器和设备3.1 分析天平：感量0.0001g3.2 精密pH计：精确至0.013.3 磁力加热搅拌器3.4 分光光度计：应符合GB9721有关规定，0.5cm比色皿3.5 电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.1℃3.6 计时器：每小时误差不超过五秒3.7 移液器：100～1000μL3.8 微量进样器：0～50μL4试剂和溶液4.1 试剂：柠檬酸 C6H8O7·H2O柠檬酸三钠 Na3C6H5O7·2H2O酒石酸钾钠 KOCO(CHOH)2COONa·4H2O3,5-二硝基水杨酸 C7H4N2O7氢氧化钠 NaOH苯酚C6H5 OH无水亚硫酸钠 Na2SO34.1 缓冲液配制：取柠檬酸C6H8O7·H2O 5.4克与柠檬酸三钠 Na3C6H5O7·2H2O 21.9克用950ml蒸馏水溶解，测定pH，用3.0mol/l 的盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH 至4.80,定容至1000 ml。
4.2 10mg/ml木聚糖：精密称取燕麦木聚糖(sigma X-0627)1.0000g，置40mL0.1M的氢氧化钠溶液中，于70℃下磁力加热搅拌2小时。
冷却至室温，用3M盐酸溶液调pH值至4.80，然后用4.1 缓冲液定容至100ml。
标记为1.0%木聚糖溶液，同时标记pH及配制日期。
4℃条件下保存，有效期7天。
木聚糖酶酶活测定
木聚糖酶的酶活测定方法一、原理木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的木聚糖酶的活力成正比。
酶活定义方法木聚糖酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂榉木木聚糖（sigma），木聚糖酶（苏柯汉），木糖50mmol NaAC-HAC、DNS试剂、50mmol柠檬酸-Na2HPO4、50mmol甘氨酸-NaOHDNS（1L）配置方法：取3,5-二硝基水杨酸6.3g溶于500ml水中，45℃水浴溶解后，加2mol/L的NaOH 262ml，不停搅拌，然后加入185g酒石酸钾钠，溶解后加入5g结晶酚（或6.25ml 80%的苯酚），溶解后加入亚硫酸钠5g，搅拌至溶解后冷却定容至1L。
4℃保存，7天后可用，若有絮状物请过滤后使用，有效期为6个月。
50mmol NaAC-HAC：称取3.402gNaAC·3H2O 溶于蒸馏水中，定容至500ml；用移液器移取1.428ml HAC溶于蒸馏水中，定容至500ml。
两者按V（NaAC）：V（HAC）≈2:1 体积配比，用pH计调节到pH5.0。
50mmol柠檬酸-Na2HPO4：称取柠檬酸5.2535gNa2HPO4 4.477g，溶于蒸馏水中定容至250ml；称取柠檬酸5.2535g溶于蒸馏水中定容至500ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。
50mmol甘氨酸-NaOH：称取甘氨酸0.3735g溶于蒸馏水中，定容100ml；称取NaOH 0.200g 溶于蒸馏水中，定容100ml；用pH计调节pH至所需pH值的缓冲液。
三、仪器水浴锅、分光光度计、电热套、烧杯、具塞刻度试管、移液器、电子天平四、标准曲线的绘制1、木糖标准液的配制：准确称取100mg分析纯的无水木糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容转移到100ml容量瓶中，再定容至刻度，摇匀，浓度为1mg/ml。
木聚糖酶活性测定操作规程
木聚糖酶活性测定操作规程一、原理：木聚糖酶（Xylanase EC 3.2.1.8）属水解酶类，能分解戊聚糖为戊糖。
用木糖为酶的作用底物。
木聚糖酶将木聚糖分解为木糖。
木糖与3，5—二硝基水杨酸在沸水中加热后，被还原成棕红色的氨基化合物。
在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度显比例关系，用比色法可测知被木聚糖酶分解生成的木糖量。
用酶解的木糖量确定酶的活性。
二、试剂的配制1.3，5—二硝基水杨酸的配制(又称DNS试剂)：甲液的配制：取6.9g结晶苯酚（密度1.054 ，45℃）溶于15.2mL10%氢氧化钠中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液的配制：取255g酒石酸钾钠，加到300mL10%氢氧化钠中，再加入880mL1% 3，5—二硝基水杨酸溶液。
2.木聚糖试剂配制：0.2M，pH 4.8醋酸缓冲溶液配制：取1.6059gNaAc·3H2O和4.7mLHAC于1L容量瓶中定容。
称1g木聚糖于0.2M pH 4.8醋酸缓冲溶液中，加热溶解，于100mL容量瓶中定容。
3.0.1%木聚糖标准溶液配制：准确称取100mg木糖，用少量的蒸馏水溶解后，定容至100mL，冰箱保存备用。
4.1% 3，5—二硝基水杨酸的配制：称8.8g 3，5—二硝基水杨酸溶于871.2mL蒸馏水中。
5.10%NaOH配制：称32gNaOH溶于288mL蒸馏水中，即得320mL10%氢氧化钠。
三、木糖标准曲线的制定2.以木糖含量（mg）为X轴，吸光度A值为Y轴，绘制标准曲线。
三、木聚糖酶活性分析操作步骤：A、样品的制作：1.每个测试样取三支25mL具塞刻度试管，分别加入0.5毫升的木聚糖液，置50℃恒温水浴中预热10min。
2.再加入经适当稀释的酶液0.5mL（控制吸光值A在0.2~0.3的范围），在50℃恒温水浴中反应15min 。
3. 立即取出加入1.5mLDNS 和1mL 蒸馏水摇匀，中止酶的分解反应。
检测饲料添加剂中木聚糖酶活力
料分 子 被 释放 到溶 液 中 ． 通 过测 定 溶 液 中染料 浓
员， 质 量监 督 员 。
度就 可 以就算 出酶活 这种 测定 方法 经常被 一些
纠蝌广￣ ２ ０ １ ３ 年第２ １ 期
２ ７
对 于 规 范 饲料 酶 市 场 和促 进 行 业 健康 发 展 都 是 很有 必要 的
饲 料 用 木 聚糖 酶 的实 际作 用 底 物 是 不 溶 于
水 的 与葡 聚糖 、 果胶 、 甘 露 聚糖 、 木 质 素 和 蛋 白质 等 生物 大分子 结合在 一起 在 天然木 聚糖 与水组 成 的 多相 体 系 中 ，酶 总是 处 于底 物不 饱 和状 态 ．
样， 发 酵 酶 活 的差 异 也很 大 ． 使 用 效 果更 是 千 差 万别 。制定 一个 科 学 的评 判方 法 （ 或者“ 标准” ） ．
１ 检 测 木 聚 糖 酶 活 力 的 方 法
测 定木 聚 糖酶 活力 的方法 主 要有 以下 ３种 ：
①黏度法 ； ②底物染色法 ； ③还原糖法 。
力 酶 与底 物 的反应 是 在 固相界 面 上进 行 的 ． 其 酶 解 反 应 速率 受 到底 物 对 酶 蛋 白吸 附速 率 和 产
物 扩散 速率 的限制 ． 所 以选 用实 际 反应 底 物进 行 分 析是很 困难 的 目前 通常 采用 的底 物是溶 于水
剂中木聚糖酶活力应注意 ： 固定 反 应 体 系 ， 即 固定 反 应 温 度、 ｐ Ｈ值 、 反应时间 、 底 物 浓 度 和要 求 的产 物 浓 度 范 围 。 建
议 以 燕 麦 木 聚 糖 为 标 准 底 物 ．反 应 液 中底 物 的 浓 度 为 ５ ｍｇ ／ ｍ Ｌ：配制 的木 聚糖 底 物 溶 液 的存 放 时 间不 超 过 １ ２ ｈ ．
木聚糖酶测定方法
木聚糖酶测定方法
木聚糖酶是一种重要的酶类，其主要作用是分解木质纤维素中的木聚糖。
木聚糖酶测定方法是指用生化方法对其进行检测，以了解其含量及活性。
下面，将介绍几种常见的木聚糖酶测定方法。
一、显色法
显色法是一种常用的木聚糖酶测定方法。
该方法利用代表性的显色剂（如3,5-二硝基水杨酸或酚碘酸盐）与还原糖的酶解产物反应，生成可见光的吸收峰，从而测定酶的活性。
二、比色法
比色法是一种颜色比较法。
该方法根据不同的反应原理，选用不同的显色剂，然后与样品反应，并用比色卡比较吸收峰的颜色深浅，进而测定酶的活性。
三、电化学法
电化学法是一种经典的酶测定方法。
该方法利用电化学反应对酶进行检测。
对于木聚糖酶的测定方法，常用电化学法从分子角度分析木聚
糖酶的催化活性和催化机理。
四、荧光法
荧光法是一种非常灵敏的酶检测方法。
该方法基于荧光基团与某些物
质产生能量转移的原理，将酶活性变化转换为能量转移信号，以此测
定其活性。
五、放射测量法
放射测量法是一种高分辨率、高灵敏度的酶测定方法，主要用于分析
微量酶的活性。
该方法通过放射性标记掺杂检测物，利用放射性衰变
原理来测量酶的活性，准确度高。
总的来说，木聚糖酶测定方法有许多种，各有其各的优点和适用范围。
因此，在选择适合的方法时，需要根据实际情况综合考虑。
随着科学
技术的不断发展，人们对木聚糖酶测定方法也越来越深入研究，相信
未来将会有更多更精准的方法出现。
木聚糖酶测定的有关问题
饲料用木聚糖酶活力测定的研究文章来源：农业部饲料工业中心作者：陆文清等更新时间：2011-03-30饲料用木聚糖酶的分析测定是长期以来困扰木聚糖酶生产和应用的一个主要难题,特别是固态发酵生产的木聚糖酶,发酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶等)[1-3]。
文献报道的关于影响酶活测定的因素很多,测定的重复性较差 [4-5，7]，除了温度和pH值以外,还存在着其它很多不确定的因素。
本文将从底物的性质和浓度、酶样的稀释度、离子强度和反应时间等方面讨论对酶活测定的影响,提出比较可行的饲料用木聚糖酶的分析方法。
酶活定义为在37 ℃和设定pH值条件下，每分钟内从底物溶液中降解释放1 μmol/l还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。
测定木聚糖酶活力的方法主要有3种：粘度法、底物染色法和还原糖法。
粘度法是通过测定木聚糖酶对底物粘度的降解速度来计算酶活力，这种测定分析方法有较好的实用价值，但是测定过程比较繁琐，而且重复性较差，目前很少采用。
底物染色法是一种比较简便快速的测定方法,其基本原理是以木聚糖为基质,用胶联方式连接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡,质量稳定的片剂。
这种片剂容易溶于水溶液中,与木聚糖酶反应后,长链的木聚糖被降解,结合的染料分子被释放到溶液中。
通过测定溶液中染料的浓度,就可以就算出酶活力。
这种测定方法经常被一些专业生产生物酶的大型企业采用。
但是它只能测定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。
还原糖法是通过测定还原糖的产量来计算酶活力。
这种分析方法也比较简便，而且重复性也比较好。
国内外关于木聚糖酶的研究报告多数采用这种方法。
这种方法的主要不足是不能很好地分析内切酶的活力，而内切酶的活力对于饲料酶的实际使用效果来说是很重要的。
如果希望通过测定木聚糖酶在某一标准状态下的活力来判断木聚糖酶质量的优劣或者预测其动物饲喂效果是远远不够的。
木聚糖酶的实际作用底物是不溶于水的高聚物，它们主要存在于植物种子的表皮层内，与葡聚糖、果胶、甘露聚糖、木质素和蛋白质等生物大分子结合在一起。
木聚糖酶检测方法
木聚糖酶活力的测定分光光度法1 原理木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。
2 木聚糖酶活力单位（U）的定义在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 µmol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。
其中样品的酶活力以U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示。
桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood）3 主要仪器3.1 分光光度计3.2 精密电子天平精确至0.0001 g。
3.3 恒温水浴锅30-60℃可调，精度为0.1℃。
3.4 酸度计精确至0.01。
3.5 秒表每小时误差不超过5s。
3.6 刻度试管（15mL）带玻璃塞，10支以上。
3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL）3.8分样筛孔径为0.25 mm（60目）。
3.9 分析天平精确至0.001 g。
3.10 磁力搅拌器附加热功能。
3.11 电磁振荡器3.12烧结玻璃过滤器孔径为0.45 μm。
3.13 离心机3000 r/min3.14 冰箱4 试剂与溶液配制除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L）吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。
木聚糖酶和CMC活力的测定方法
木聚糖酶活力的测定方法1. 方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。
2.原理：还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。
溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。
3. 主要仪器和设备天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。
4. 试剂和溶液4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。
4.2 DNS试剂称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。
室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
4.3 0.1mol/L，pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液吸取冰醋酸1.8ml,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解, 定容至1000ml,调节PH 至5.00±0.01后使用。
室温下存放2个月有效。
4.4 0.1%即1mg/ml木糖标准溶液无水木糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
4.5 1.0%木聚糖溶液称取木聚糖1.00g于烧杯中，用2ml 0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40ml 缓冲液，于60～70℃水浴中加热溶解，冷凉后用0.5mol/L醋酸（约2ml）调pH5.0，转入容量瓶中,加缓冲液(4.3)定容至100ml。
如果冰箱中放置时间长了出现沉淀，使用前应在热水浴中热溶。
4.6 木糖标准曲线的绘制吸取1mg/ml木糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。
以吸光度为纵坐标，木糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与木糖量的关系。
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木聚糖酶活力的测定
分光光度法
1 原理
木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。
反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。
2 木聚糖酶活力单位（U）的定义
在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 µmol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。
其中样品的酶活力以U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示。
桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood）
3 主要仪器
3.1 分光光度计
3.2 精密电子天平
精确至0.0001 g。
3.3 恒温水浴锅
30-60℃可调，精度为0.1℃。
3.4 酸度计
精确至0.01。
3.5 秒表
每小时误差不超过5s。
3.6 刻度试管（15mL）
带玻璃塞，10支以上。
3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL）
3.8分样筛
孔径为0.25 mm（60目）。
3.9 分析天平
精确至0.001 g。
3.10 磁力搅拌器
附加热功能。
3.11 电磁振荡器
3.12烧结玻璃过滤器
孔径为0.45 μm。
3.13 离心机
3000 r/min
3.14 冰箱
4 试剂与溶液配制
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L）
称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L）
吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。
4.3 乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1 mol/L）
称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。
4.4 乙酸——乙酸钠（CH3COOH — CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1 mol/L，pH为
5.0）
称取三水乙酸钠19.17 g，加入冰乙酸3.60 mL。
再加水溶解，定容至2000 mL。
测定溶液的pH值。
如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。
用精密pH试纸检定。
4.5 木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0 mg/mL）
称取无水木糖1.000 g，加乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 mL。
4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/L）
称取木聚糖（Sigma X0627）1.00 g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90 mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。
然后停止加热，继续搅拌30 min，加入0.8 mL冰乙酸。
继续磁力搅拌，测定其pH值。
如果pH值为5.0，用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。
如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0，
然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。
木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。
4℃避光保存，有效期为3天。
4.7 DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g（化学纯），加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45℃。
然后逐步加入100 mL氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。
）。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g 和无水亚硫酸钠2.50 g。
继续45℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。
用烧结玻璃过滤器过滤。
取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。
4.8 乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液
量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液，加入0.15gTriton X-100（曲拉通100），0.15g 牛血清白蛋白（BSA）混合均匀。
如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。
5 标准曲线的绘制
吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0 mL，加入DNS试剂（4.7）3.0 mL，沸水浴加热5 min。
用自来水冷却至室温，用水定容至15.0 mL，制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL，分别用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL，配制成浓度为300、400、500、600、700、800 μg/mL木糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00 mL（做三个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入1.0 mL缓冲液（4.4）（终浓度分别为：0,150，200，250，300，350和400µg/mL）和3.0 mL DNS试剂（4.7）。
振荡3 s，沸水浴加热5 min。
然后用自来水冷却到室温，再用蒸馏水定容至15 mL。
以标准空白样为对照调零，在540 nm处测定吸光度OD值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新
表一：木糖标准曲线制作数据记录
用EXCEL 线性回归，得到回归方程，用于后续酶活力的计算：
y(µg/mL)=a·OD540nm + b --------------------------------------------------（2）
得：a= ；b= .
6 试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm），称取1.000g样品，精确至0.001 g。
加入40 mL乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）。
高速磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。
上离心机（3.13）4000r离心3min，取上清液，再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释（吸光度OD540nm值应控制在0.2-0.6之间，否则需重新稀释再做）。
（注：当以麸皮或玉米芯份做载体的样品时，应使用乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液（4.8）抽提，但应使用乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液（4.4）稀释。
）
液体样品可以直接用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）进行稀释、定容（稀释后吸光度在0.2-0.6之间）。
如果稀释后酶液的pH值偏离5.0，需要用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节校正至5.0，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
7 测定步骤
吸取10.0 mL木聚糖溶液（5.6），40℃平衡10 min。
吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液，40℃平衡10 min。
酶空白样制作：
吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入3mL DNS试剂（4.7），电磁振荡3 s。
然后加入1.0 mL木聚糖溶液（4.6），40℃反应20 min，沸
水浴加热5 min。
用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s。
以此作为反应空白调零。
酶反应样制作（需作3个平行）：
吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），加入到刻度试管中，再加入1.0 mL木聚糖（4.6）（已经过40℃平衡），电磁振荡3 s，40℃精确保温20 min。
加入3.0 mL DNS 试剂（4.7），电磁振荡3 s，以终止酶解反应。
沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s。
以酶空白样为调零，在540 nm处测定吸光度A。
跟据回归方程计算出还原糖量，即y值。
8 试样酶活的计算
Y × N × 2
X D = ------------------------（2）
20 × 150
X D—试样稀释液中木聚糖酶的活力，U/mL或者U/g；
Y —根据样品吸光度OD540nm，用回归方程计算出的还原糖量（即y值），单位为：µg/mL；
N —从固体样品到测定前最终液的总稀释倍数；
2 —酶促反应体积为2.0 mL。
150 —木糖分子量，转化为μmol；
20 —酶解反应效时间20,min；
酶活力的计算值保留三位有数字。
表二：样品活力测定结果数据记录
注：由公式2的回归方程求出结果。
9 重复性
每个试样应取二份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。