第11章 动物细胞培养与表达制备药用

皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要 保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层 真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健 康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人 自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活 人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的， 取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈 合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就 要被身体排斥。
2、历史：
• 1907年,哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝 玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液 中，存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长 过程，开创了动物组织培养的先河。 • 法国学者卡雷尔（Carrell）设计的卡氏培养瓶 1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大 推动了动物细胞培养技术的建立。
11-2 动物细胞培养的特点
（二）动物细胞培养类型与形态 • 体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细 胞接触抑制性、密度抑制性的特点。 1、类型：
• 贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附 着在固体或半固体表面才能生长，另外也 包括细胞间相互接触。
11-2 动物细胞培养的特点
• 悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同， 动物细胞中只有极少数细胞体外生长可在 培养液中悬浮生长，培养密度高、效率高。 血液白细胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等 属于此类细胞。
胰蛋白酶
50代细胞
无限传代
11-1 动物细胞培养概念与历史
1、动物细胞培养（Animal cell culture）： 是模拟动物体内生理环境使细胞在体外分裂 增殖的一种技术。包括：
• 原代培养：动物细胞进行首次传代前的培 养过程。
• 传代培养：将原代培养细胞继续转接培养 的过程。
11-1 动物细胞培养概念与历史
（2）合成培养基
• 优点：成分已知，便于对培养条件进行控制。
• 缺点：无法替代天然培养基中一些未知成分 • 解决途径——合成培养基中添加小牛血清，彼此互 补 目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、 F12、M199等，具体配方参见本章附录（P123）
（2）合成培养基
例如
• MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功。 含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的 无机盐，组成简单。 • DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在MEM培 养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量， 同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500mg/L） 和低糖型（1,000mg/L），高糖型适合生长较快、 贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培养。
11-3 动物细胞培养工具与条件
4、动物细胞培养常用溶液
（1）平衡盐溶液（Balanced salt solution， BSS ）主要由生理盐水和葡萄糖组成，具有维持细 胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。 • 例如：Hanks液、Earle液（缓冲能力强） • 注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂： 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
（芽、根） 细胞次生
植物体细胞杂交
植物细胞A 去细胞壁 植物细胞B 愈伤组织
原生质体融合
杂种细胞
植 物 组 织 培 养
植物细胞融合
杂种植株
这个过程中涉及的原理是？ 细胞膜的流动性 植物细胞的全能性
动物胚胎或幼龄动 动物细胞培养过程： 物的组织、器官
剪碎 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
单个细胞
加培养液
细胞悬浮液 10代细胞
11-2 动物细胞培养的特点
• 接触抑制性 (Contact inhibition) 是指由 于动物细胞相互接触 而抑制细胞运动性的 现象（图）。由于这 个特性，正常细胞并 不会相互重叠，而是 呈单层细胞生长。
11-2 动物细胞培养的特点
• 密度抑制(Density inhibition) 细胞接触 汇合成片后，细胞仍能进行增殖分裂。但 是当细胞密度达到一定程度后，营养相对 缺乏，代谢产物增多，发生密度抑制生长 现象。
11-2 动物细胞培养的特点
2、贴附型细胞四种形态 （1）成纤维型细胞
外形与体内成纤维细胞形状相似， 细胞大致呈梭形或不规则形，中 央有圆形核，胞质向外伸出2－3 个长短不同的突起，成群细胞呈 现放射状、旋涡状等形式。多数 细胞之间排列疏散，有较大的细 胞间隙。除成纤维细胞外，心肌、 成骨肌细胞等起源于中胚层细胞 培养时均属这一类型。
11-3 动物细胞培养工具与条件
1、培养工具
• 多为玻璃或无毒塑料制成的： 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长显 微镜观察的扁平形状。 培养皿 培养管 仪器包括：CO2培养箱、相差显微镜等。 目前大多采用微载体(多孔塑料培养板)作为 介质培养贴附型细胞生长，类似悬浮培养效 果。
11-3 动物细胞培养工具与条件
11-3 动物细胞培养工具与条件
血清的生物功能
• 1.提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、 脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物 质。 • 2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮 质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。 生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、 血小板生长因子等。 • 3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低 分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及 激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢 过程中起重要作用。
4、动物细胞培养常用溶液
（2）培养基pH调整液
• 动物细胞对酸碱度要求十分严格，大部分合成培 养液都呈微酸性，若灭菌前调整到标准值，灭菌 后又会降低，因此pH调整液应单独配制和灭菌， 在培养液灭菌后再加入调整pH值最好。 • 常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶 液、HEPES液等。 注：HEPES （4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离 子两性缓冲液，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有较好的 缓冲能力：
• 3、培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切 力敏感。 • 4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。
11-2 动物细胞培养的特点
• 5、原代细胞培养繁殖50代左右即退化死亡。 • 6、对营养需求更加苛刻，除常规营养外还 需血清等。 • 7、对培养条件或环境极其敏感。 • 8、容易受污染。 • 9、大多需要贴附在固体或半固体表面才能 生长。
11-2 动物细胞培养的特点
（4）多形型细胞
• 多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，包括细 长型胞突和多角形胞体。
• 多形型细胞不常见，体外培养呈现多形型细胞的 细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。
11-2 动物细胞培养的特点
实际上，体外培养的动物细胞形态常受培 养条件影响，呈现过渡形态。 影响细胞形态学特征的主要因素包括： ① 血清成分 ② 培养基成分及添加成分 ③ 培养基的酸碱度 ④ 气相环境 ⑤ 温度等
11-3 动物细胞培养工具与条件
血清对培养中的细胞起到某些保护作用：
• 提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损 伤。血清蛋白形成的粘度，可以保护细胞搅拌时 免受机械损伤。 • 血清中含有抗蛋白蛋白酶的消化作用。 • 血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解 毒中起重要作用，如硒等。
11-1 动物细胞培养概念与历史
• 1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物 细胞体外培养的培养基。伴随着培养工具 与培养基的不断完善，动物细胞体外培养 技术日益成熟。
11-2 动物细胞培养的特点
（一）动物细胞培养特点
• 1、动物细胞无细胞壁，比微生物细胞大
• 2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢
11-2 动物细胞培养的特点
（3）游走型细胞
• 细胞呈分散生长，一般不连接成 片，胞质常伸出伪足和突起，呈 活跃游走或变形运动，方向不规 则，在器皿上生长位置不固定。 此型细胞不稳定，外形不断变化， 密度大时难以和成纤维、上皮细 胞相区别。
•
包括单核巨噬细胞系统：白细胞、 淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞 等。
思考如果一个大面积烧伤的病人来说，
自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。 如何才能获得大量的自体健康皮肤？
下篇 动物细胞工程
第11章 动物细胞培养与表达 制备药用蛋白
本章主要内容
• 1. 动物细胞培养的概念、历史 • 2. 动物细胞培养的特点 • 3. 动物细胞培养工具与条件 • 4. 体外培养细胞生长与增殖过程 • 5. 细胞株与保存 • 6. 动物细胞小规模培养
（3）无血清培养基
• 血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的 成分 血清培养基缺点： （1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用 （2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过程 不易检测控制。 （3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养产 物的分离、提纯以及检测造成一定困难。
（3）无血清培养基
4、动物细胞培养常用溶液
（4）抗生素溶液 作用：防止微生物污染。 • 常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、 制霉菌素等。 通常是青霉素和链霉素联合使用：培养基内 最终使用浓度 为 青霉素100U/ml、链霉素 100微克/ml（双抗）。
11-3 动物细胞培养工具与条件
3、培养基 动物细胞对营养要求较高，包括必需氨基酸、 维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、 生长因子、血清（多数情况下需加入10%的胎 牛或小牛血清）等。 分类：天然、合成、无血清培养基三种。
（1）天然培养基
• 直接采用取自动物体液或是从组 织中提取的成分做培养液。常用 动物血清（胎牛血清、小牛血 清）、组织提取液、鸡胚胎汁等。 优点：营养价值高，培养效果好 缺点：成分复杂、来源有限、成本 较高 • 血清（serum）：纤维蛋白已被 除去(如通过血凝或去纤维蛋白 法)的血浆。
• 另外，同微生物、植物细胞培养不同，动 • 物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受 高温灭菌，多采用40nm过滤除菌（例如支 原体污染。
11-3 动物细胞培养工具与条件