单克隆抗体

单克隆抗体技术——伏马菌素B1快速检测试剂盒

每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

用任何抗原、半抗原，包括各种细菌、激素、酶素、病原体、氨基酸序列、核酸，还有其他异体蛋白或糖蛋白等抗原物质，都可以用杂交瘤技术获得相应的单克隆抗体。因而人们可以在体外或动物体内按自己的需要，生产不同类型的单抗。现在，已经可以制出多种病毒、细菌、支原体、霉菌、寄生虫表面抗原，癌胚抗原，血型红细胞抗原，移植抗原，肿瘤相关抗原，多种血清成份，DNA ，RNA ，基因片段等等单克隆抗体。已应用单克隆抗体制成免疫荧光技术，酶免疫吸附实单克隆抗体技术及其在食品卫生检验中的应用。

抗体药物的研发关键步骤主要包括：抗体靶点的确定、抗体库的建立、表达载体的构建、细胞株的筛选，中试工艺、临床前研究及临床研究。

到2016年全球约有250亿美元单抗药物的专利到期，抗体药仿制时代来临。据美国投资公司Collins Stewart估计，开发一种适应症的单克隆抗体生物仿制药将会花费1亿美元，新的治疗性抗体的开发将花10～16年和5亿～10亿美元，而且生物仿制药成稿概率高达90%，明显高于生物新药研发概率。单抗药物价格非常昂贵，在我国接受全自费Avastin和Erbitux等的治疗，每剂5000—6000元，年治疗费用在18万元左右。生物仿制药较原研药安全性相当，但是在价格上有显著竞争优势，安全效益比更高。

抗体药物下游纯化工艺的开发是

一个复杂的过程，需要综合考虑纯度、收

率、成本、时间等因素。我国抗体药物产

业化的主要限制因素有三个方面：动物细

胞大规模培养、抗体大规模纯化及药物质

量分析和质量保证。单抗药物对生产制造

纯化工艺的效能和成本要求非常高，抗体

药物开发的60%资金投入都在下游纯化

工艺的建立，药物制造成本可达到售价的

20-25%，其生产的关键原材料是无血清

培养基和重组蛋白A亲和层析介质，无

血清培养基和重组蛋白A亲和层析介质

将决定生产成本、纯度、收率。无血清培

养基要求无血清、无动物源，重组蛋白A

亲和层析介质主要考虑动态载量、线性流

速、耐碱清洗。

伏马菌素(fumonisins)是一组由串珠镰刀菌产生的霉菌毒素。到目前为止,已发现的伏马菌素有11种,分别命名为FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP。伏马菌素B1是串珠镰刀菌培养物中伏马菌素的主要组分,是污染玉米的主要组分,同时也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。研究表明FB1可以诱发马脑白质软化症和猪的肺水肿综合症(PPE)。国际癌症研究中心(IARC)把伏马菌素划分到2B组,即人类可能的致癌物。

伏马菌素广泛存在于世界范围的玉米及其制品中,对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁,成为真菌毒素中继黄曲霉毒素后的又一个研究热点。自伏马菌素被发现后,立刻引起世界各国的广泛重视,相继建立了各种检测方法,对伏马菌素在食品中的污染状况进行了广泛的调查,一些国家相继制定了伏马菌素在食品及饲料中的限量标准。世界范围的污染调查显示,玉米污染伏马菌素的状况十分严重。玉米在人类饮食结构及动物饲料中占有相当比例,特别是在一些相对落后地区如非洲、亚洲的一些地区,玉米是人们的主要粮食,所以建立玉米及玉米制品中伏马菌素的检测方法及限量标准有重要意义以免疫化学为基础的ELISA检测试剂盒,就有快速、简便、灵敏、经济的特点,适宜大规模的筛查工作。

伏马菌素B1快速检测试剂盒的制作成本比较昂贵。整个制作过程中用到CO2培养箱、洁净工作台、生物倒置显微镜、酶标分析仪、电子分析天平、低温高速离心机、电泳仪、微量可调移液器、细胞培养板、酶标板、玻璃及塑料制品等相关仪器。试剂用到伏马菌素B1、牛血清白蛋白、抗体亚类测定试剂盒、RPMI 1640培养基、HAT选择性培养基、HEPES,

福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMF),吐温20(Tween 20)、聚乙二醇(PEG,MW 4000),

青霉素、链霉素、辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG、30%H2O2等。

整个制备包括下面几个流程：实验方法、人工抗原的制备、免疫动物细胞融合、杂交瘤筛选及抗体检测、杂交瘤细胞的克隆化、单克隆抗体的生产、单克隆抗体的纯化、单克隆抗体的鉴定。

一、伏马菌素B1快速检测试剂盒制作中，首先制备溶液系统ELISA使用液，其制作过程如下：(1)包被液:0.05mol L碳酸盐缓冲液,pH9.6。(2)洗涤液:PBS-T,即含0.05%Tween20的0.05mol L PBS(V V)。(3)底物缓冲液:0.1mol L柠檬酸加0.2mol L磷酸氢二钠,pH5.0。(4)底物溶液:10mg TMB加入1ml二甲基甲酰胺,冷冻保藏。用时取此溶液75μl加10ml底物缓冲液

和10μl H2O2。(5)终止液:2mol LH2SO4。(6)抗体稀释液:含0.1%BSA的0.05mol LPBS。采

用的是小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 0由本室传代,并经8-氮杂鸟嘌呤处理。

二、样品提取：研磨玉米使其90%可通过250～500μm网筛。称取5g加到100ml具塞三角烧瓶中,加入1.25g NaCl及25ml甲醇水溶液(80∶20)。强力震荡3min。经滤纸过滤。滤液用1%NaCl稀释10倍进行检测。

三、间接竞争抑制性ELISA法检测

(1)用伏马菌素B1-BSA包被酶标微孔板,每孔120μl,4℃过夜;

(2)酶标板用PBS-T洗3×3min后,加入不同浓度的卵白蛋白(OA)标准溶液(制作标准曲线)或样品提取液(检测样品)与单克隆抗体(McAb)的混合液100μl(该液系毒素标准液或样品提取液与McAb按1∶1比例混合,在试验前配好,4℃过夜备用),置37℃,1.5h;

(3)酶标板用PBS-T洗3×3min后,加入酶标二抗,每孔100μl,置37℃,50min;

(4)酶标板用PBS-T洗3×3min后,加入底物溶液,每孔100μl,置37℃,10min;

(5)加入终止液每孔50μl,于450nm处测定吸光度值。每孔100μl,(6)计算公式∶OA含量(μg kg)=5CX式中:C:酶标板上测得的OA浓度(ng ml),根据标准曲线求得;X:样品提取液稀释的倍数。

试剂盒各项技术中的参数为产品的质量提供了直观的数据。整个产品的参数有检出限、回收率、保存期、抗体的交叉反应率、实验室内的变异程度、实验室间的变异程度等。

整个产品面向的市场是各省市的农科院、植保站等农业检测部门，对粮食采购质量有要求的饲料公司、食品公司等具有能使用该试剂盒的公司单位，目前国内尚无该产品或类似产品在售。

成功地筛选出能够分泌抗伏马菌素B1的单克隆抗体细胞株,制备出针对伏马菌素B1具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体,建立了FB1ELISA检测方法并研制出具有我国自主知识产权的FB1ELISA检测试剂盒,对开展全国性伏马菌素污染调查及制定粮食中推荐限量标准建议值具有重要的科学价值和应用意义。