细胞免疫功能检测方法PPT课件
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➢ 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFNγ与IL4的变化
➢ 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗 的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位
15
IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用[4],诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症[5]. IFN-γ 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成 IgE[6].
Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要[2,4]. 由于CD4+分子
16
B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院 2007-08-242007博士
14
应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细 胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、 有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环 境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。
0 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
/mL，所以NDV浓缩抗
吸光度
原的蛋白浓度为4150μg
/mL。
7
脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
8
培养时间对斑点数的影响
9
NDV抗原浓度对斑点数的影响
10
影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。
11
➢ 在ELISPOT板的移动过程中 也要避免ELISPOT板的摇动， 否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多。
12
13
ELISPOT应用实例
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22， 抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值， 此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小 鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性 检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
20
Байду номын сангаас
17
18
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
19
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
3
ELISPOT的流程
4
5
底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被 抗体，包被量通常在1-2μg/mL （1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。
2
ELISPOT检测的优点
灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。
细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授
报告人：李梅
1
ELISPOT是什么？
ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，
能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。
6
标准曲线的建立和蛋白含量的确定
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
➢ Ｆolin酚法（20ug/ml-
500mg/ml）
300
250
y = 629.1x
➢ NDV浓缩抗原作1:25稀
200
释，在650nm波长下比
150
色，吸光度为0.264,带
100
入回归方程式y=629.1x，
50
求得蛋白含量为166μg
➢ 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗 的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位
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IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用[4],诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症[5]. IFN-γ 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成 IgE[6].
Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要[2,4]. 由于CD4+分子
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B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院 2007-08-242007博士
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应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细 胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、 有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环 境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。
0 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
/mL，所以NDV浓缩抗
吸光度
原的蛋白浓度为4150μg
/mL。
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脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
8
培养时间对斑点数的影响
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NDV抗原浓度对斑点数的影响
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影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。
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➢ 在ELISPOT板的移动过程中 也要避免ELISPOT板的摇动， 否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多。
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ELISPOT应用实例
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22， 抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值， 此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小 鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性 检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
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Байду номын сангаас
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结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
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感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
3
ELISPOT的流程
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底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被 抗体，包被量通常在1-2μg/mL （1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。
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ELISPOT检测的优点
灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。
细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授
报告人：李梅
1
ELISPOT是什么？
ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，
能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。
6
标准曲线的建立和蛋白含量的确定
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
➢ Ｆolin酚法（20ug/ml-
500mg/ml）
300
250
y = 629.1x
➢ NDV浓缩抗原作1:25稀
200
释，在650nm波长下比
150
色，吸光度为0.264,带
100
入回归方程式y=629.1x，
50
求得蛋白含量为166μg