细胞免疫功能检测方法PPT课件
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临床免疫学检验 课件 第15章 免疫细胞标志和功能检测技术
PMBC
Ficoll 分离液
(聚蔗糖-泛影葡胺）
２份6%聚蔗糖蒸馏水溶液 １份34%泛影葡胺生理盐水溶液
纯度达 95%
上层：血浆
外周血
Ficoll
白膜层 中层：分离液
底层：红细胞和多核细胞
二 、淋巴细胞分离
?贴壁粘附法 ?吸附柱过滤法 ?Percoll 分离液法
1.贴壁黏附法
PBMC
37℃ 1 hour
? 外周血单个核细胞分离 ? 淋巴细胞的分离 ? T、B细胞和 T细胞亚群的分离
一、外周血单个核细胞分离
?外周血单个核细胞（ peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和
单核细胞（monocyte ）。
?分离原理 ：根据比重不同进行分离
血小板
PBMC
多核白细胞
红细胞
? 对分离介质的要求：
– 对细胞无毒； – 基本等渗；
分离介质 是关键
– 与血浆和分离细胞不相溶；
– 有特定的比重。
? 不同动物的PBMC 比重有差异：
– 小鼠：1.085
– 大鼠：1.087
– 人：1.075～1.090
? 常用Ficoll分离液(1.077±0.001)分离人的
1. E花环沉淀法
成熟T细胞具有CD2分子 能结合绵羊红细胞
方法：淋巴细胞 +SRBC 悬液→加入分层液
→T细胞形成 E花环而沉于管底 →悬液
中为B细胞。
缺点：分离效率低，易受多种因素影响
2. 尼龙毛分离法(吸附能力差异)
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞
3. 亲合板结合分离法—分离亚群
高中生物细胞免疫ppt课件
05
CHAPTER
细胞免疫的应用
疫苗接种是预防传染病的有效手段，通过刺激机体产生特异性免疫反应，从而产生抗体和记忆细胞，提高机体对病原体的抵抗力。
疫苗的研发需要了解病原体的抗原特性、免疫原性以及机体的免疫反应机制，通过选择合适的疫苗佐剂、免疫途径和接种方案，达到预防和控制传染病的目的。
器官移植是治疗某些严重器官疾病的有效手段，通过将器官从一个个体转移到另一个个体，以替代病变器官的功能。
VS
细胞免疫应答是指T细胞介导的免疫应答，通过激活巨噬细胞和NK细胞等效应细胞来清除抗原。细胞免疫应答具有识别抗原的特异性，能够直接杀伤靶细胞或释放淋巴因子激活其他免疫细胞来杀伤靶细胞。
细胞免疫应答可分为三个阶段：感应阶段、反应阶段和效应阶段。在感应阶段，抗原被巨噬细胞等抗原提呈细胞摄取和处理，暴露出其抗原决定簇，再呈递给T细胞；在反应阶段，T细胞与抗原提呈细胞的识别导致T细胞的活化、增殖和分化；在效应阶段，活化的T细胞释放淋巴因子，激活巨噬细胞和NK细胞等效应细胞来清除抗原。
细胞免疫在肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用，例如CAR-T细胞疗法和PD-1抑制剂等治疗方法，都是基于细胞免疫的原理来设计。这些治疗方法通过调节机体免疫反应，增强肿瘤细胞的抗原性，提高机体的抗肿瘤能力。
06
CHAPTER
总结与复习
细胞免疫的基本概念
细胞免疫是生物体通过细胞对病原体的识别和清除，以维持内环境稳态的一种防御机制。
掌握细胞免疫的基本概念和原理。
了解细胞免疫在人体健康和疾病中的作用。
培养学生对生物学的兴趣和好奇心，提高他们的科学素养。
02
CHAPTER
细胞免疫基础知识
免疫系统是人体的重要防线，负责抵御外来病原体入侵。
CHAPTER
细胞免疫的应用
疫苗接种是预防传染病的有效手段，通过刺激机体产生特异性免疫反应，从而产生抗体和记忆细胞，提高机体对病原体的抵抗力。
疫苗的研发需要了解病原体的抗原特性、免疫原性以及机体的免疫反应机制，通过选择合适的疫苗佐剂、免疫途径和接种方案，达到预防和控制传染病的目的。
器官移植是治疗某些严重器官疾病的有效手段，通过将器官从一个个体转移到另一个个体，以替代病变器官的功能。
VS
细胞免疫应答是指T细胞介导的免疫应答，通过激活巨噬细胞和NK细胞等效应细胞来清除抗原。细胞免疫应答具有识别抗原的特异性，能够直接杀伤靶细胞或释放淋巴因子激活其他免疫细胞来杀伤靶细胞。
细胞免疫应答可分为三个阶段：感应阶段、反应阶段和效应阶段。在感应阶段，抗原被巨噬细胞等抗原提呈细胞摄取和处理，暴露出其抗原决定簇，再呈递给T细胞；在反应阶段，T细胞与抗原提呈细胞的识别导致T细胞的活化、增殖和分化；在效应阶段，活化的T细胞释放淋巴因子，激活巨噬细胞和NK细胞等效应细胞来清除抗原。
细胞免疫在肿瘤免疫治疗中发挥了重要作用，例如CAR-T细胞疗法和PD-1抑制剂等治疗方法，都是基于细胞免疫的原理来设计。这些治疗方法通过调节机体免疫反应，增强肿瘤细胞的抗原性，提高机体的抗肿瘤能力。
06
CHAPTER
总结与复习
细胞免疫的基本概念
细胞免疫是生物体通过细胞对病原体的识别和清除，以维持内环境稳态的一种防御机制。
掌握细胞免疫的基本概念和原理。
了解细胞免疫在人体健康和疾病中的作用。
培养学生对生物学的兴趣和好奇心，提高他们的科学素养。
02
CHAPTER
细胞免疫基础知识
免疫系统是人体的重要防线，负责抵御外来病原体入侵。
细胞免疫ppt课件
APC提呈的抗原信息与T细胞表面的受体相匹配时，T细胞被激活，开始 增殖并分化为效应T细胞或记忆T细胞。
T细胞激活
T细胞激活需要双信号刺激，第一信号来自抗原提呈细胞（APC）的抗原信息，第二信号来 自辅助性T细胞（Th）分泌的细胞因子。
第一信号使T细胞进入激活状态，第二信号促进T细胞的增殖和分化，形成效应T细胞或记忆 T细胞。
T细胞激活后，会分泌细胞因子等效应分子，进一步调节免疫应答。
细胞因子的作用
细胞因子是由免疫细胞分泌的调节分 子，在免疫应答中发挥重要作用。
不同的细胞因子在免疫应答中发挥不 同的作用，如干扰素-γ（IFN-γ）促 进Th1细胞的分化，而白细胞介素-4 （IL-4）促进Th2细胞的分化。
细胞因子可以调节T细胞的增殖、分 化以及效应功能，如促进T细胞的活 化、增殖和分化为Th1、Th2、Th17 等亚型。
B淋巴细胞
产生特异性抗体，参与体液免疫 应答。
巨噬细胞
吞噬作用：吞噬并消 化病原体和细胞碎片 。
细胞因子分泌：调节 免疫反应。
抗原提呈：将抗原信 息传递给淋巴细胞。
树突状细胞
抗原提呈
高效地摄取、处理和提呈抗原。
免疫激活
刺激初始T细胞增殖和分化。
免疫调节
抑制或促进T细胞应答。
其他细胞
自然杀伤细胞
调节T细胞
非特异性地杀伤被感染的细胞或肿瘤 细胞。
抑制其他T细胞的活化，维持免疫稳 态。
细胞毒性T细胞
通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞 。细胞免疫来自激活与03调节
抗原识别
抗原识别是细胞免疫的第一步，主要依赖于抗原提呈细胞（APC）和T细 胞之间的相互作用。
APC通过吞噬、加工和提呈抗原，将抗原信息传递给T细胞，激活T细胞 的免疫应答。
T细胞激活
T细胞激活需要双信号刺激，第一信号来自抗原提呈细胞（APC）的抗原信息，第二信号来 自辅助性T细胞（Th）分泌的细胞因子。
第一信号使T细胞进入激活状态，第二信号促进T细胞的增殖和分化，形成效应T细胞或记忆 T细胞。
T细胞激活后，会分泌细胞因子等效应分子，进一步调节免疫应答。
细胞因子的作用
细胞因子是由免疫细胞分泌的调节分 子，在免疫应答中发挥重要作用。
不同的细胞因子在免疫应答中发挥不 同的作用，如干扰素-γ（IFN-γ）促 进Th1细胞的分化，而白细胞介素-4 （IL-4）促进Th2细胞的分化。
细胞因子可以调节T细胞的增殖、分 化以及效应功能，如促进T细胞的活 化、增殖和分化为Th1、Th2、Th17 等亚型。
B淋巴细胞
产生特异性抗体，参与体液免疫 应答。
巨噬细胞
吞噬作用：吞噬并消 化病原体和细胞碎片 。
细胞因子分泌：调节 免疫反应。
抗原提呈：将抗原信 息传递给淋巴细胞。
树突状细胞
抗原提呈
高效地摄取、处理和提呈抗原。
免疫激活
刺激初始T细胞增殖和分化。
免疫调节
抑制或促进T细胞应答。
其他细胞
自然杀伤细胞
调节T细胞
非特异性地杀伤被感染的细胞或肿瘤 细胞。
抑制其他T细胞的活化，维持免疫稳 态。
细胞毒性T细胞
通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞 。细胞免疫来自激活与03调节
抗原识别
抗原识别是细胞免疫的第一步，主要依赖于抗原提呈细胞（APC）和T细 胞之间的相互作用。
APC通过吞噬、加工和提呈抗原，将抗原信息传递给T细胞，激活T细胞 的免疫应答。
细胞免疫的检查 ppt课件
CD3：↑
CD3 ： ↓
（1）甲亢、淋巴细胞性甲状腺炎 （1）原发性细胞免
（2）传染性单核细胞增多症 （3）急性淋巴细胞型白血病 （4）重症肌无力 （5） SLE活动期 （6）排斥反应
疫缺陷病（如先天 无 胸腺症）
（2）某些恶性肿瘤 （3）流感、麻疹等
病毒感染
（4）多发性神经炎
CD4： ↑ 类风湿性关节炎 重症肌无力 自身溶血性贫血 移植排斥反应
转化的淋巴细胞数
淋巴细胞转化率 =
×100%
转化的淋巴数 +未转化的淋巴数
正常参考值（PHA） 60%~80%
优点：简便易行，便于基层推广 缺点：易受主观因素影响，重复性差
讨论1、为什么用PHA刺激T细胞可使T
细胞分裂增生？
如何
2、B淋巴细胞转化试验应该
进行？
美洲商陆OR葡萄球菌A蛋白
NK细胞活性测定
CD4 CD8 CD25
T（辅助/诱导）细胞、 Mφ、HIV受体 T（杀伤/抑制）细胞、 NK细胞的亚型 活化T细胞、IL-2受体
Lymphocyte subsets
1. 分群：
Common CLP Lymphoid
precursor
T
T CELLS (CD3)
CD4
Th
T HELPER CELLS Activate B cells
标志物
流式细胞术
T细胞 表面分化抗原：CD3\4\8\25等
B细胞
膜表面IgG测定(smIg)
(Surface membrane immunoglobulin SmIg)
表面分化抗原(CD19\20\22等)
NK细胞 表面分化抗原 …
流式细胞术
免疫应答—细胞免疫应答(免疫学检验课件)
APC表面的B7等协同刺激分子与Th表面的 CD28结合，形成Th细胞活化的第二信号。 在双信号的刺激下，CD4+Th细胞被活化， 在局部微环境中IL-12等细胞因子的作用 下，分化为效应CD4+Th1细胞。
Th1细胞在抗胞内病原体感染中的作用
（二）CD8+Tc（CTL）细胞的免疫效应
胞内病原体(病毒、肿瘤、胞内寄生菌)被 APC处理后结合为抗原肽-MHCⅠ类分子复合 物，并运送至APC表面与Tc细胞的TCR和CD8 分子结合，形成Tc活化的第一信号。
（三）细胞免疫的生物学作用
1.抗感染作用 2.抗肿瘤免疫 3.引起免疫损伤，如超敏反应
细胞免疫应答的基本过程
内源性抗原的加工处理
CD8+T细胞活化双信号示意图
在CD4+Th细胞的辅助下，Tc细胞高表达CD28 等黏附分子并与靶细胞表面的B7等配体结 合，形成协同刺激信号，即Tc细胞活化的 第二信号 。
在双信号的刺激下，Tc 细胞活化来自增殖、 分化为效应Tc细胞。CTL杀伤靶细胞的过程
其主要特点： 1.具有抗原特异性 2.受MHC-I类分子限制 3.可连续杀伤靶细胞，杀伤效率高
（一）CD4+Th1细胞的免疫效应
CD4+Th1细胞由活化的CD4+Th分化而来，在宿主抗 胞内病原体感染中具有重要作用。抗原被APC摄取， 处理，形成抗原肽-MHC II类分子复合物表达在细 胞表面，与Th细胞的TCR和CD4分子结合，形成 CD4+Th活化的第一信号。
外源性抗原的加工处理
T细胞活化相关信号分子
细胞免疫应答
免疫应答
抗原物质激发机体免疫系统后发生一系列 反应以排除该抗原应答的过程。
免疫细胞及其功能检验技术—吞噬细胞功能检测(免疫学检验课件)
方法： 1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），温育25min； 2.推片染色、镜检（含甲臜颗粒的中性粒细胞）。
正常值： NBT阳性细胞率应7%~15%
二、巨噬细胞功能检测
• 炭粒廓清试验：主要用于动物实验 • 吞噬功能检测：（吞噬鸡红细胞或白假丝酵母等） • 促凝血活性测定：
（一）炭粒廓清试验
在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后， 用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时 各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、 聚集程度等。健康正常人一般2～3小时后开始聚集， 达50～100个，6小时可达1000个以上。
体外法--Boyden小室法
Boyden 小室
体外法--琼脂糖平板法
液混合，温育后涂片、固定和染色。在油镜下观察
中性粒细胞对细菌的吞噬情况，计数100个细胞中吞
噬和未吞噬细菌的中性粒细胞数，并记录吞噬的细
菌数。
吞噬率
吞噬细菌的中性粒细胞数 计数的中性粒细胞数
100%
吞噬指数
吞噬的细菌总数 吞噬细菌的中性粒细胞数
100%
（三）中性粒细胞杀伤功能检测 硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验
正常小鼠肝中库普弗细胞可吞噬清除90％炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注 射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取 静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓 清的速度，判断巨噬细胞的功能。
主要用于动物实验
（二）巨噬细胞吞噬功能检测
巨噬细胞
＋
鸡红细胞或 白假丝酵母
孵育
等），B细胞（增殖、分泌抗体能力），NK（杀伤）， 中性粒细胞（趋化、吞噬、杀伤），巨噬细胞（吞噬 功能--炭粒廓清、鸡红细胞吞噬实验）
正常值： NBT阳性细胞率应7%~15%
二、巨噬细胞功能检测
• 炭粒廓清试验：主要用于动物实验 • 吞噬功能检测：（吞噬鸡红细胞或白假丝酵母等） • 促凝血活性测定：
（一）炭粒廓清试验
在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮皮肤后， 用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时 各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开始时间、 聚集程度等。健康正常人一般2～3小时后开始聚集， 达50～100个，6小时可达1000个以上。
体外法--Boyden小室法
Boyden 小室
体外法--琼脂糖平板法
液混合，温育后涂片、固定和染色。在油镜下观察
中性粒细胞对细菌的吞噬情况，计数100个细胞中吞
噬和未吞噬细菌的中性粒细胞数，并记录吞噬的细
菌数。
吞噬率
吞噬细菌的中性粒细胞数 计数的中性粒细胞数
100%
吞噬指数
吞噬的细菌总数 吞噬细菌的中性粒细胞数
100%
（三）中性粒细胞杀伤功能检测 硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验
正常小鼠肝中库普弗细胞可吞噬清除90％炭粒， 脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注 射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取 静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓 清的速度，判断巨噬细胞的功能。
主要用于动物实验
（二）巨噬细胞吞噬功能检测
巨噬细胞
＋
鸡红细胞或 白假丝酵母
孵育
等），B细胞（增殖、分泌抗体能力），NK（杀伤）， 中性粒细胞（趋化、吞噬、杀伤），巨噬细胞（吞噬 功能--炭粒廓清、鸡红细胞吞噬实验）
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When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
19
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
11
➢ 在ELISPOT板的移动过程中 也要避免ELISPOT板的摇动， 否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多。
12
13
ELISPOT应用实例
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22， 抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值， 此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小 鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性 检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。
14
应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细 胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、 有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环 境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。
2
ELISPOT检测的优点
灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。
3
ELISPOT的流程
4
5
底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被 抗体，包被量通常在1-2μg/mL （1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。
0 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
/mL，所以NDV浓缩抗
吸光度
原的蛋白浓度为4150μg
/mL。
7
脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
8
培养时间对斑点数的影响
9
NDV抗原浓度对斑点数的影响
10
影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。
细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授
报告人：李梅
1
ELISPOT是什么？
ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，
能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
20
6
标准曲线的建立和蛋白含量的确定
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
➢ Ｆolin酚法（20ug/ml-
500mg/ml）
300
250
y = 629.1x
➢ NDV浓缩抗原作1:25稀
200
释，在650nm波长下比
150
色，吸光度为0.264,带
100
入回归方程式y=629.1x，
50
求得蛋白含量为166μg
➢ 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFNγ与IL4的变化
➢ 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗 的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位
15
IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用[4],诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症[5]. IFN-γ 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成 IgE[6].
Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要[2,4]. 由于CD4+分子
16
B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院 2007-08-242007博士
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
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感谢聆听
不足之处请大家批评指导
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11
➢ 在ELISPOT板的移动过程中 也要避免ELISPOT板的摇动， 否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要 进行严格的无菌操作，试验 过程中各步的洗涤工作一定 要充分。否则会造成背景的 不清晰，针尖样杂斑的增多。
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ELISPOT应用实例
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出， 小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22， 抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值， 此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小 鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性 检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。
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应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细 胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细 胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、 有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环 境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。
2
ELISPOT检测的优点
灵敏度高：在一百万个阴性细胞中只要有 一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测 出来。灵敏度高于ELISA 。 单细胞水平：ELISPOT 检测的是单个活细 胞的分泌。 操作简便：不需专门的实验仪器设备。可 按照标准化的实验操作，可以同时处理数 百个样品（Kalyuzhny AE 2005）。
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ELISPOT的流程
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5
底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被 抗体，包被量通常在1-2μg/mL （1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水 纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液， 加入检测细胞进行细胞培养。
0 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
/mL，所以NDV浓缩抗
吸光度
原的蛋白浓度为4150μg
/mL。
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脾淋巴细胞浓度对斑点数的影响
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培养时间对斑点数的影响
9
NDV抗原浓度对斑点数的影响
10
影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是 试验成功进行的先决 条件，凡是活力高功 能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定 背景干净，阴性对照 斑点少，而试验组斑 点圆润鲜亮。
细胞免疫功能检测方法 ELISPOT的建立及应用
指导老师： 常维山教授 柴家前副教授 刘永庆教授
报告人：李梅
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ELISPOT是什么？
ELISPOT ： 全名为酶联免疫斑点检测。 它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，
能够在单细胞水平检测细胞因子等分泌物的分 泌情况 原理可概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌 的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现 出来（Sedgwick JD 2005）。
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
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6
标准曲线的建立和蛋白含量的确定
牛血清白蛋白含量（ug/ml）
➢ Ｆolin酚法（20ug/ml-
500mg/ml）
300
250
y = 629.1x
➢ NDV浓缩抗原作1:25稀
200
释，在650nm波长下比
150
色，吸光度为0.264,带
100
入回归方程式y=629.1x，
50
求得蛋白含量为166μg
➢ 老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IFNγ与IL4的变化
➢ 疫苗研究开发：ELISPOT 检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的 指标之一（Harrop R et. al., 2004）。对于某些持续性感染疾病，疫苗 的细胞免疫保护效果甚至居于主要地位
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IL-4可以促进B细胞分化、增殖,在IgE诱导合成 中起关键作用[4],诱导气道上皮细胞产生内毒 素,趋化嗜酸性粒细胞,加重气道炎症[5]. IFN-γ 与IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA 转录水平,并抑制由IL-4诱导的B细胞合成 IgE[6].
Th1/Th2亚群的失衡,与许多人类疾病有关,多 数认为,支气管哮喘中,Th2亚群及所属细胞因 子占优势,在该病的发生发展中作用重要[2,4]. 由于CD4+分子
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B7-H1/PD-1抑制途径对慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能影 响的研究陈良恩中国人民解放军军事医学科学院 2007-08-242007博士