蛋白检测篇1-Western Blot
Western bloting 检测蛋白质含量变化
Western blotting 检测蛋白质含量变化溶液配方注意事项细节一、细胞收集、蛋白提取及浓度测定1、细胞收集及蛋白提取（1）培养瓶培养的细胞：以25cm2培养瓶培养细胞至90％汇合，加入各种药物处理后，用冷的PBS洗两遍，吸去瓶内培养液（可用枪头尽量吸干净），加入200ul冷的PBS在冰环境下用细胞刮刮下细胞收集到1.5mlEP管中，再用500ul冷的PBS洗培养瓶2遍，所有液体都转到EP管中，3500-4500rpm 4℃离心5min，去上清，弃净PBS，借助另一1.5mlEP管估计细胞体积。
向EP管中加入6-10倍体积细胞裂解液（碧云天强型RIPA裂解液495ulRIPA +5ul 100mM PMSF），在冰上裂解45-60min，期间弹打EP管几次或涡旋使细胞裂解充分，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。
（2）24孔板培养的细胞：去培养液，加冷的PBS冲洗2次，弃净PBS加细胞裂解液60-70ul，冰上裂解60min，期间可反复吹打，裂解后吸至EP管中，12000rpm 4℃离心30min，上清吸至新的EP管中。
2、蛋白浓度测定BCA法测定蛋白浓度（1）取10ul 5mg/mlBSA蛋白标准，加入90ulPBS，得0.5ug/ul BSA标准蛋白工作液（2）取2mlBCA试剂A，加入0.04mlBCA试剂B（50：1），得BCA工作液，此工作液室温24h内稳定。
（3）按下表制备标准曲线及测定样品蛋白浓度编号 1 2 3 4 5 6 7 8 90.5ug/ulBSA标准工作液（ul）0 1 2 4 8 12 16 20PBS（ul）20 19 18 16 12 8 4 0 20-x 样品（ul）x BCA工作液（ul）200 200 200 200 200 200 200 200 200蛋白含量（ug）0 0.5 1 2 4 6 8 10OD570 0以OD562为纵坐标，蛋白含量（ug）为横坐标，以1-8号管做标准曲线，从标准取线上查出样品的蛋白质含量（ug），除以测定样品的体积（ul）即的样品蛋白质浓度（ug/ul）。
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
Western blot检测蛋白质的表达实验的结论通常包括以下几个方面：
1. 蛋白质的表达水平：通过比较目标蛋白质与内参蛋白质的信号强度，可以得出目标蛋白质在样本中的表达水平。
2. 蛋白质的分子量：通过比较标准蛋白的分子量和目标蛋白质的分子量，可以确定目标蛋白质的分子量。
3. 蛋白质的特异性：通过比较阳性对照和阴性对照的信号强度，可以确定目标蛋白质的特异性。
在Western blot检测蛋白质的表达实验中，需要注意以下事项：
1. 样本制备：确保样本的质量和数量，避免样本降解或污染。
2. 抗体选择：选择特异性好、灵敏度高的抗体，避免出现非特异性反应。
3. 实验条件：保持实验条件的稳定和一致性，避免影响实验结果的可重复性。
4. 数据分析：对实验数据进行准确的分析和解释，避免误导实验结果。
总之，Western blot检测蛋白质的表达实验是一种常用的生物化学技术，可以用于研究蛋白质的表达、功能和相互作用等方面。
在实
验中需要注意细节和规范操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项 -回复
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项-回复西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项引言：蛋白质是细胞功能的重要组成部分，对于研究蛋白质的表达和功能非常关键。
西方博LOT（Western blot）是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于分析特定蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质的大小和相对丰度以及判断蛋白质的分子量。
本文将介绍西方博LOT检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项。
一、实验结论：1. 确定目标蛋白质的存在与否：在Western blot实验中，通过探针的特异性结合，可以确定目标蛋白质在待检样品中的存在与否。
如果探针与待检样品中的蛋白质结合，会出现特异的蛋白质带，从而可以确定目标蛋白质的存在。
2. 确定目标蛋白质的大小和相对丰度：通过Western blot实验的结果，可以确定目标蛋白质的大小和相对丰度。
在蛋白质电泳分离后，较大的蛋白质会相对较靠近电极负极，较小的蛋白质会相对较靠近电极正极。
通过与已知分子量蛋白质标准曲线的对比，可以确定待检样品中目标蛋白质的分子量。
3. 分析蛋白质的表达水平：通过Western blot实验的结果，可以分析目标蛋白质在不同样品中的表达水平。
通过比较待检样品中蛋白质带的强度，可以初步判断蛋白质的相对表达量。
进一步，可以使用图像分析软件对蛋白质带的强度进行定量分析，获得更精确的表达量数据。
二、实验注意事项：1. 样品处理：西方博LOT实验的样品处理是关键的一步。
样品的存储和处理方式可能会对实验结果产生影响。
为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样品应尽快冷冻保存，并在实验前严格遵循相关处理方法。
2. 磷酸盐缓冲液的配制和pH调整：磷酸盐缓冲液是Western blot实验中的关键试剂，用于制备电泳缓冲液、转膜缓冲液和洗涤缓冲液。
正确配制磷酸盐缓冲液的浓度和pH值是确保实验的准确性和稳定性的重要因素。
3. 蛋白质的电泳分离和转膜：蛋白质的电泳分离要求严格的电泳条件。
总蛋白Westernblot检测
总蛋白Westernblot检测[正常成纤维细胞总蛋白的提取]（1）培养正常成纤维细胞，待细胞生长密度达到70-80%时更换无血清培养基培养并且加入处理因素。
（2）以下所有步骤均在冰上操作。
在到达处理时间后，将培养瓶取出置于冰上。
弃去原培养基，用预冷的PBS溶液清洗细胞两次。
（3）每个培养瓶中加入400μl RIPA细胞裂解液（其中含有1% PMSF试剂），摇晃培养瓶使RIPA均匀分布在小皿中。
用细胞刮将瓶中的细胞尽量刮至角落。
用移液枪将全部液体移入新的预冷的EP管中。
（4）冰上裂解30 min，每5 min最大涡旋10秒。
（5）12000g，4℃离心15min。
（6）转移上清至新的预冷的1.5 ml EP管中。
用Qubit蛋白定量检测方法测定细胞总蛋白含量。
[ Western-blot操作步骤]（1）蛋白样品前处理：蛋白样品与5×Loading Buffer按4:1比例混匀，在沸水中煮5min，瞬离后待用。
上样总体系为30μ1，不足的部分用1×Loading Buffer补充，（2）配胶：配置10%的分离胶，放置30min后待分离胶凝固后在其上配置5%的浓缩胶，并且插上10孔的梳子，放置90min，收好备用。
（3）SDS-PAGE电泳：使用微量进样针给每孔加样，浓缩胶电压为70V，电泳30min；待到溴酚蓝前沿进入分离胶后，将电压调整到120V，电泳60-80min，使得溴酚蓝电泳到分离胶底部。
剪取合适大小的PVDF膜，用甲醇浸泡5min，然后浸于电转液中备用。
其他电转部件充分浸泡于回收电转液中15min。
（4）转膜：电泳完成后，小心取出玻璃板，厚板朝下用割胶刀轻轻撬开薄板，将PVDF膜贴上，按照膜的大小和预染maker的指示切割凝胶，将切下的胶和膜在新鲜配置的电转液中浸泡10min以上。
转膜按照经典Western三明治法负极朝下依次放置海绵、厚滤纸、凝胶、PVDF膜、厚滤纸以及海绵，注意赶走每层中的气泡。
westernblot实验操作指南
蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南目录目录 (1)一、总蛋白的提取 (2)1 试验类型和蛋白类型 (2)2 样品组织类型 (3)3 蛋白表达峰度判断 (4)4 总蛋白提取的基本步骤 (4)4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 (5)4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 (5)二、总蛋白BCA定量 (6)三、SDS-PAGE凝胶电泳 (7)四、转膜 (8)五、信号增强剂处理膜 (9)六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 (9)1 封闭 (9)2 一抗孵育 (9)3 二抗孵育 (13)七、曝光显色 (14)八、灰度分析 (15)九、抗体及相关溶液配制 (15)1 抗体 (17)2 相关溶液配制表 (17)蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多，Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。
Western Blot的原理并不复杂，网上有很多这方面的材料，这里不作过多的介绍。
虽然原理、操作并不复杂，但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。
其操作过程中涉及到：蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容，其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响，最终导致试验失败。
很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题，大部分情况都会最终把矛头指向抗体，认为这个抗体质量不好。
抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响，但绝不是全部。
你的操作方法可能是对的，但，是否合理、是否适合你的试验要求，你可能未必了解。
我们课题组Western Blot的任务量极重（每年ECL的用量都在5L以上），课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题，我不可能为每一个人找到问题的关键点，因此，写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要，希望你们可以针对自己的问题，自我分析、自我解决，这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项西方博(Western blot) 是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质样品经过电泳分离并转移到膜上，再使用特异性抗体检测蛋白质的表达水平。
以下是西方博检测蛋白质表达实验的结论和注意事项。
结论：1. 蛋白质的分子量：西方博通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的精确分子量。
根据蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以使用特定的分子量标准品绘制标准曲线，并在曲线上确定待测蛋白质的分子量。
2. 蛋白质的表达水平：西方博使用特异性抗体来检测特定蛋白质的表达水平。
利用特异性抗体与目标蛋白质的特定区域结合，然后使用辅助抗体标记抗体，并通过光学或化学方法检测抗体标记物的表达水平。
比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平可以确定其相对表达量。
注意事项：1. 样品的提取和准备：蛋白质的准备和提取是西方博实验的首要步骤。
样品应该被充分破碎，并使用适当的提取缓冲液来维持蛋白质的稳定性。
注意，使用不同类型的组织或细胞时，提取条件和方法可能有所不同。
2. 蛋白质的电泳分离：西方博通常使用SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来进行蛋白质的分离。
凝胶的浓度和隔离电泳条件应选择适当，以分离不同分子量的蛋白质。
3. 转膜：将电泳分离的蛋白质转移到膜上是西方博的关键步骤之一。
选用合适的膜（如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素膜），并选择适当的电泳缓冲液进行转膜。
确保蛋白质能够均匀地转移到膜上。
4. 抗体的选择和试验条件：特异性抗体的选择和充分优化是确保实验准确性的关键因素。
保证抗体的特异性和亲和性，并验证抗体的工作浓度。
此外，充分优化抗体和探针的试验条件，包括反应温度、时间和抗体浓度等。
5. 成像和分析：西方博实验完成后，使用适当的成像方法（如化学发光或荧光成像）检测抗体标记物的表达水平。
使用适当的成像系统记录图像，确保信号处于线性范围内。
使用图像分析软件进行定量分析，比较待测蛋白质与内参蛋白质的表达水平。
WB：WesternBlot-蛋白质印迹法
WB：WesternBlot-蛋⽩质印迹法「源」是格源致善对在个性化肿瘤疫苗研究领域内有重⼤突出贡献的⼈物或创新性的事件进⾏报道的专题。
⼀、蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
Western blot的发明者⼀般认为是美国斯坦福⼤学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。
在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析⽣物化学》（AnalyticalBiochemistry）中⾸次被称为WesternBlot。
WB的基本原理：在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测，经常⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋⽩的互作。
依其原理，可分为直接法和间接法两种⽅法，两种⽅法的⽐较如表1表1 WB直接法和间接法的⽐较⼆、WB实验步骤Western Blot的内容主要包括以下⼏个步骤：1）制样：裂解缓冲液或者超声处理。
（使⽤RIPA裂解液是需按照100:1加⼊蛋⽩酶抑制剂）2）电泳：根据蛋⽩⼤⼩确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋⽩。
3）转膜：湿转和半⼲转都可。
但在待检测蛋⽩分⼦量较⼤或低内源⽔平湿转移⽅法更佳。
4）洗膜：10min/次*3次。
5）封闭：含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。
6）洗膜：TBST中洗涤10min。
7）孵育⼀抗：⼀抗应在含5% BSA 或5% 脱脂⽜奶的 TBST 缓冲液中稀释，参考产品说明书选择合适的⼀抗稀释⽐例。
5%推荐使⽤脱脂奶粉的TBST缓冲液，背景相对较低。
⼀抗4℃孵育过夜更好。
8）洗膜：10min/次*3次。
9）孵育⼆抗：建议在含5%脱脂⽜奶TBST中稀释⼆抗.参考⽣产商建议选择合适的⼆抗稀释⽐例。
10）洗膜：10min/次*3次。
生物实验教案：利用WesternBlot技术检测蛋白质
生物实验教案：利用WesternBlot技术检测蛋白质【导言】生命科学是一门探究生命基本结构、功能、特点及其规律的学科。
而生物技术作为生命科学的重要组成部分，不断涌现新的技术和方法，使得生物研究更加丰富多彩。
Western Blot技术被广泛应用于蛋白质研究领域，是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测技术，其在学术界和医学相关领域得到了广泛应用。
本文将详细讲解Western Blot技术的原理、步骤及其在生物研究中的应用。
【正文】一、Western Blot技术原理Western Blot技术也被称为蛋白印迹技术，是一种通过电泳分离样品中的蛋白质，然后通过膜转移、靶向蛋白质的抗体检测等步骤来检测特定蛋白质的方法。
其主要原理如下：（1）电泳分离样品中的蛋白质：Western Blot技术使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等方法对样品进行分离，使用电泳输送将被分离出的蛋白质定位到凝胶上的特定位置。
（2）将分离的蛋白质转移到膜上：通过将电泳分离后的蛋白质沿着凝胶内向膜传递，以便用于后续的检测。
（3）使用特定抗体检测蛋白质：在Western Blot技术中，抗体通常会用于标识目标蛋白质的位置。
一旦目标蛋白质与其特异的抗体结合，就可以使用一种物质，如酶的亚基底物或放射性同位素，来标记蛋白质并检测其浓度。
（4）显影：加入染色剂等物质对目标蛋白质进行着色，便于蛋白质的可视化。
二、Western Blot技术步骤Western Blot技术主要包括以下步骤：（1）样品准备：样品收集、破碎、裂解等操作是Western Blot 技术操作的第一步，为后续操作提供样本。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳分离：先将样品进行电泳分离，分离后的蛋白质会在聚丙烯酰胺凝胶上生成一个不同的蛋白质条带，以便于辨别目标蛋白质。
（3）转膜：将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到膜上。
膜通常可以是呈现带电的（如聚偏亚胺酯，PVDF）和不呈现带电的（如硝酸纤维素）。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。
收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。
根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。
因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。
100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。
煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。
蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。
两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。
然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。
(完整word版)蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
中文名蛋白质印迹法外文名 Western Blot蛋白免疫印迹 Western Blot类似方法1 Southern Blot杂交方法类似方法2 Northern Blot杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳 [1]原理与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
[1]分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
蛋白质westernblot检测方法介绍
蛋白质westernblot检测方法介绍①将蛋白电泳后的凝胶浸入电转缓冲液中15min。
②将电转膜（醋酸纤维素膜）先在甲醇中浸泡至完全湿润（甲醇用于活化电转膜上的基团，可能是使得膜上的正电性增强），然后再将膜浸入超纯水中5min，最后再将膜浸入电转液中15min。
③滤纸先在电转液中完全浸湿，然后将滤纸平铺在电转纤维上，在滤纸正上方平铺凝胶，在凝胶正上方平铺电转膜，在电转膜正上方平铺滤纸，最后用玻棒赶气泡。
（注：滤纸一定要比电转膜略小，也可比凝胶略小，最好与凝胶大小一致；电转膜应与凝胶大小一致或略大；理论上，电转膜的大小只要能够覆盖住目标区域即可）。
④100V，电转100min。
（注：电转仪置于冰浴中，并且电转仪中还要放入搅拌子；注意电转时的正负极，黑色朝向黑色）。
⑤电转结束后，将电转膜浸泡于甲醇中5min，最后将电转膜浸泡于4ml 10%的牛奶（2g奶粉溶于20ml超纯水）中（5%BSA），置于37℃摇床（75rpm）封闭1.5h（也可4℃封闭过夜）。
（注1：若采用预览的Marker可以在转膜结束后看到Marker条带是否转移到膜上，据此判断蛋白条带是否转移到膜上，因此可省略丽春红浸泡观察等过程，直接封闭。
注2：不论是封闭还是后面的加一抗和二抗，都要将自封袋中的气泡赶走，尤其是大气泡，因为大气泡的存在阻隔了牛奶、一抗和二抗与膜的接触，不利一抗与二抗的接触，导致后面显色不明显；摇床转速不能太快，否则会一抗与二抗即使结合了又会被甩分开）。
⑥封闭 1.5h结束后，电转膜用PBST溶液（1L 1×PBS溶液+500ulTween-20，注意Tween粘度较大，吸取时要慢，否则吸不够量；同样地，打出时也要慢，否则会没有全部打出）洗3次，每次10min。
⑦将电转膜浸入一抗溶液中，置于37℃摇床，75rpm，1.5h（一抗溶液的制备：10ml的10%脱脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10ul一抗，即共稀释了1000-2000倍，可根据需要自行设计抗体稀释倍数）。
蛋白检测篇1-Western Blot_修正版
编号：１－１主题：Western Blot（蛋白质印迹法）概述：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
目的：获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
步骤：1.提取组织或细胞蛋白；2.测定蛋白质浓度；3.电泳：电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）；4.电转膜仪转膜：转膜条件为：恒流250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；8.二抗孵育：室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。
9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。
10.显色流程图：。
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编号：１－１
主题：Western Blot（蛋白质印迹法）
概述：
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
目的：
获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
原理：
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
步骤：
1.提取组织或细胞蛋白；
2.测定蛋白质浓度；
3.电泳：
电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止（约120min）；
4.电转膜仪转膜：
转膜条件为：恒流250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；
5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；
6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；
7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；
8.二抗孵育：
室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。
9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。
10.显色
流程图：。