鹿结核分枝杆菌流行株Rv3874_Rv3875融合基因的克隆及原核表达

第18卷第4期经济动物学报Vol.18No.4 2014年12月Journal of Economic Animal Dec．2014鹿结核分枝杆菌流行株Ｒv3874－Ｒv3875融合基因的克隆及原核表达*曾范利1，王文玉2，宋纪伟3，时坤1，李健明1，刘东旭2，刘杨2，杜锐1，4＊＊（1．吉林农业大学中药材学院，长春130118；2．吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；3．吉林市人民医院，吉林132001；4．教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省药用动物二级实验室，长春130118）摘要：以吉林农业大学经济动物疾病实验室分离并保存的鹿结核分枝杆菌流行株为模板，利用重叠延伸剪接技术（Splicing by overlap extension，SOE）设计引物，克隆Ｒv3874－Ｒv3875融合基因，构建重组表达质粒pGEX－4T－1－Ｒv3874－75，在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达，并对目的蛋白进行纯化，表达产物通过SDS－PAGE和Western blot进行分析。

结果表明：测序后融合基因Ｒv3874－Ｒv3875的序列与GenBank 中序列的符合率为100%，重组表达质粒pGEX－4T－1－Ｒv3874－75在大肠杆菌中成功诱导表达，获得可溶性表达的融合蛋白，经SDS－PAGE分析该蛋白的相对分子质量约49ku，经Western blot鉴定纯化好的融合蛋白能与鹿结核病的阳性血清发生反应，具有良好的反应原性。

关键词：鹿结核分枝杆菌；流行株；融合基因；克隆；原核表达中图分类号：S858.94；Q78文献标识码：A文章编号：1007-7448（2014）04-0209-05引文格式：曾范利，王文玉，宋纪伟，等．鹿结核分枝杆菌流行株Ｒv3874－Ｒv3875融合基因的克隆及原核表达［J］．经济动物学报，2014，18（4）：209-213．DOI：10．13326/j．jea．2014．1030Cloning and Prokaryotic Expression ofＲv3874－Ｒv3875Fusion Gene of Deer Mycobacterium tuberculosis Epidemic StrainsZENG Fan-li1，WANG Wen-yu2，SONG Ji-wei3，SHI Kun1，LI Jian-ming1，LIU Dong-xu2，LIU Yang2，DUＲui1，4（1．College of Chinese Medicine Materials，Jilin Agricultural University，Changchun130118，Chi-na；2．College of Animal Science＆Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；3．Jilin People's Hospital，Jilin132001，China；4．Key Laboratory of Animal Production，Product Quality and Security，Ministry of Education of the People'sＲepublic of China，Level2La-boratory of Medical Animal of Jilin Province，Changchun130118，China）Abstract：Fusion geneＲv3874－Ｒv3875was cloned by Gene－SOE using the genomic DNA of deer mycobacterium tuberculosis wild strain that were separated and saved in laboratory of economic animal disease of Jilin Agricultural University as template as template．Then the PCＲproduct was transformed into pGEX-4T-1to gain prokaryotic expression．Constructed recombinant plasmid pGEX-4T-1-Ｒv3874-75was induced with IPTG in E．coli BL21（DE3）．The purpose protein was pu-＊＊＊基金项目：国家科技支撑计划项目（2011BAI03B02－1），国家自然科学基金项目（31372436），吉林省科技厅科技支撑计划项目（20120225），吉林省科技厅科技成果转化促进计划项目（20125067）作者简介：曾范利，女，博士，讲师，主要从事经济动物疫病研究。

收稿日期：2014-08-07通讯作者：杜锐，E-mail：durui71@126．com经济动物学报2014年rified by GST tag affinity chromatography purification system．The result showed that the compliance rate of the sequence of fusion geneＲv3874－Ｒv3875and that in GenBank was100%by sequen-cing．The fusion protein was expressed successfully in E．coli in a soluble form．SDS－PAGE and Western blot analysis induced thatＲv3874－Ｒv3875was expressed with the size about49ku and the purified protein could interact with the positive serum of deer tuberculosis，which demonstrated that the fusion protein had excellent antigenicity．Key words：deer Mycobacterium tuberculosis；epidemic strain；fusion gene；cloning；prokaryotic expression鹿结核病是一种慢性、消耗性人畜共患传染病，广泛流行于世界各地，表现为母鹿大多不产仔，公鹿出现怪角，全身被毛稀少且粗乱无光、换毛延迟，甚至被毛脱落后不再生长，严重威胁着养鹿业的健康发展［1］。

目前，BCG是唯一可用于防治鹿结核病的减毒活疫苗，但其免疫保护效果不稳定，存在一定的缺陷［2］。

动物机体接种BCG后会严重干扰皮内结核菌素反应的特异性，无法区分野毒株感染与疫苗株的免疫。

因此，本试验选取鹿结核病流行株与卡介苗之间的差异基因Ｒv3874和Ｒv3875，将其融合表达并纯化，将两个保护性抗原以一个蛋白的形式表达，既降低生产成本又简化生产过程，且无需考虑混合比例问题，通过Western blot分析显示融合蛋白具有良好的反应原性，为建立一种有效区分野毒株与疫苗株的检测方法提供候选抗原。

1材料与方法1.1菌株和载体E．coli JM109、DH5α、BL21（DE3）、表达载体pGEX－4T－1菌种，pMD18－T－Ｒv3874和pMD18－T－Ｒv3875重组克隆菌种由吉林农业大学经济动物疾病实验室保存，pMD18－T Simple Vector载体购自TaKaＲa公司。

1.2主要试剂Ex Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ、NotⅠ、T4DNA 连接酶、Pyrobest DNA Polymerase高保真PCＲ多聚酶、DL2000/15000DNA Marker、蛋白质Marker 购自TaKaＲa公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒、质粒DNA小量试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司；Glutathione Sepharose4B购自GE Health-care公司；DAB试剂盒购自北京康为世纪公司；PVDF转移膜购自Gleman公司；鹿结核病阳性血清、HＲP标记的兔抗鹿IgG为吉林农业大学经济动物疾病实验室保存。

1.3融合基因引物的设计与合成根据GenBank中Ｒv3874和Ｒv3875基因序列（BX248347.1），采用SOE法分别设计两对引物（表1）：第一对为Ｒv3874上游引物P1和下游重叠引物P2；第二对为Ｒv3875上游重叠引物P3和下游引物P4。

引物由上海生物工程股份有限公司合成。

表1扩增Ｒv3874和Ｒv3875基因的引物Table1．Primers used for amplifyingＲv387andＲv3875genes 引物名称引物（5'-3'）P1（Bam HⅠ）P2（Linker）P3（Linker）P4（Not I）CGGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC AGATCCGCCTCCACCTGAACCGCCACC TCCGAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT GGAGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGATCT ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG AGCAGCGGCCGCCTATGCGAACATCCC注：下划线部分为酶识别位点，斜体部分为Linker序列及其互补序列，P2删除终止密码子TGA1.4融合基因的克隆和测序以pMD18－T－Ｒv3874质粒为模板，P1、P2为引物，采用高保真PCＲ多聚酶，首先扩增Ｒv3874－Linker片段，其反应条件：98ħ预变性8 min；98ħ变性30s，67ħ退火1min，72ħ延伸1 min，35个循环；72ħ延伸10min。

然后以pMD18012第18卷第4期曾范利等：鹿结核分枝杆菌流行株Ｒv3874－Ｒv3875融合基因的克隆及原核表达－T－Ｒv3875质粒为模板，P3、P4为引物，采用同样的方法扩增Linker－Ｒv3875片段，其反应条件：98ħ预变性8min；98ħ变性30s，68ħ退火1 min，72ħ延伸1min，35个循环；72ħ延伸10 min。

扩增并鉴定正确后，用凝胶回收试剂盒对大量PCＲ产物进行回收，具体步骤按试剂盒说明书操作。

分别以回收产物Ｒv3874－Linker和Linker－Ｒv3875为模板，P1、P4为引物，采用Ex Taq DNA 聚合酶，分两步扩增Ｒv3874－Linker－Ｒv3875融合基因片段，第一步反应条件：95ħ预变性2min；95ħ变性30s，68ħ退火45s，72ħ延伸3min，10个循环；第二步反应条件：95ħ预变性2min；95ħ变性30s，68ħ退火45s，72ħ延伸3min，25个循环；72ħ延伸10min。