动物细胞传代培养

细胞工程实验报告

实验课程：细胞工程

实验内容：动物细胞传代培养

一实验目的

➢掌握消化法细胞传代培养的原理

➢了解细胞传代培养所需专用设备、试剂

➢学习细胞传代培养操作

二实验原理

●动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会

进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不

足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢

产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分

离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培

养瓶的过程称之为传代。80%汇合或刚汇合细胞是理想的传

代阶段。

●消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，

使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用

新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

三实验试剂及器具

⏹改良吸管加样器

⏹培养瓶（玻璃、塑料）

⏹PE液

⏹0.25%胰蛋白酶液

⏹MEM+10%小牛血清液

⏹抽滤装置

⏹超纯水器

⏹倒置显微镜

⏹二氧化碳培养箱

四实验步骤与操作

●75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，

并过火焰。

●用酒精棉球擦拭培养用液瓶盖，打开瓶盖在酒精灯火焰

上一过，盖上瓶盖，但不必拧紧

●将培养瓶内的旧培养液倒入烧杯中

●旧培养液倒掉后，镜下观察细胞十分干净、清晰

●从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器

●从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，注意吸管的

刻度面向上，加样器的柄面偏左侧，以便于操作时观察。

●将吸管过火焰（竖向）

●将吸管过火焰（横向）

●吸取PE液5ml

●从侧面加入瓶内

●平放轻摇40下，放置2~5分钟

●将PE液倒出

●吸取胰酶0.3ml

●将胰酶加入瓶中，加入时直冲细胞贴壁处，平放轻摇，

使酶液漫过整个瓶底部，放置1-2分钟，可于镜下观察，并轻拍

●在倒置显微镜上观察，发现细胞质渐渐回缩，细胞间隙

增大，细胞慢慢变圆时

●用手掌拍打瓶底和瓶侧，使细胞从瓶壁脱落下来并悬浮

和流动起来，再在显微镜下观察。

●准备好一个新瓶，松开瓶盖一圈，吸取MEM培养液5ml ●准备加入培养瓶

●将培养液加入原培养瓶

●用吸管向瓶壁吹吸数次，混合成均匀的细胞悬液后，吸

出2ml，装入一新瓶内，剩余的留于瓶内，再在两瓶中分别加入1ml和2ml的新鲜培养液

●将培养瓶口及盖过火焰后拧紧

●做上标记

●将传代好的培养瓶放置于合适温度的培养箱中（视不同

细胞要求而确定培养温度）培养

●细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）

→伸展（铺展）→扁平或梭型或多边形→繁殖→长满整

个培养瓶底→下一次传代（或冻存）

五试验中PE、胰蛋白酶作用

PE作用：

➢PE：络合、吸收、去除维持组织完整性的钙、镁离子，促进细胞分离；

➢钙、镁离子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除；

➢将残余未倒尽的血清除尽，因为血清也会抑制胰酶的消化作用；

➢洗去未倒尽的死细胞。

胰蛋白酶作用：

➢胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，水解除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离。

➢胰蛋白酶液浓度越高，消化作用越强，但超过一定限度会损伤细胞，消化时间也要适度。

六实验结果

（传代前）（传代后）

（加胰酶后）

七思考与讨论

请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。

答：

消化前细胞长满培养瓶底，细胞紧密无间隙。

消化后发现细胞质渐渐回缩，细胞间隙增大，细胞慢慢变圆，细胞从瓶壁脱落下来并悬浮和流动起来。

游离期细胞间隙增大，细胞圆球形，细胞悬浮，培养液浑浊。

贴壁期细胞扁平或梭型或多边形，透明度较好。

指数生长期培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞密度增

大。

●培养成功标志：细胞生长状态良好，透明度大；细胞内颗粒少，

没有空泡,细胞形态完整，饱满。

●成功与不成功培养及其他培养状态的差别比较：

成功的：细胞生长状态良好，透明度大；细胞内颗粒少，没有空泡,细胞形态完整，饱满。

不成功的:当细胞刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，细胞质颗粒变多，细胞延展性差。随着污染的

加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快

变黄，且浑浊。