08 第六章 环境化学物的特殊毒性及其评价-遗传毒性

3.2 哺乳动物体细胞致突变体外试验 哺乳动物细胞（正向）突变试验
哺乳动物细胞 野生型 哺乳动物细胞 野生型
BrDU
死亡
BrDU 正向突变
受试物
生长 （抗药性）
细胞株： 小鼠淋巴瘤细胞(L5178Y) 中国仓鼠肺细胞(V79) 中国仓鼠卵巢(CHO) 人成纤维细胞或淋巴细胞
3.3 染色体畸变试验
n 2n 3n 4n
2n-1 2n+1 2n+2 2n+1+1 2n-2
(ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD) (ABCD)
(ABCD) (ABC) (ABCD) (ABCD) (A) (ABCD) (ABCD) (AA) (ABCD) (ABCD) (AB) (ABC) (ABC)
2.1 DNA加合物和交联分子的形成
(3)DNA-DNA交联：DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成
共价连接. 代表物：如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气、各种铂的衍生物 后 果：DNA在复制中不能解链，螺旋局部形成，DNA复制和转录完全 停止，细胞死亡
丝裂霉素C
2.2 碱基类似物在DNA复制时的掺入
特异性(%) 3/10 (30%) 2/10 (20%)
准确性(％) 20/29 (69%) 20/28 (71%)
显性致死试验
18/18 (100%)
8/10 (80%)
26/28 (93%)
遗传毒性检测实验组合原则
1. 应包括每一类型的遗传终点。应能检出基因 突变、染色体断裂、重组作用、非整倍体或多倍 体改变。 Ames 试验，微核试验，细菌 DNA 修复试验， SCE 。 2.应包括进化程度不同的物种。 3. 体内外实验配合。体外试验应有体外活化系 统。 4.应包括生殖细胞和体细胞。
USEPA遗传毒性评价试验程序
第一阶段
Ames 试验
体外哺乳动物细
体内骨髓细胞遗传学试验 染色体畸变试验
胞基因突变试验
微核试验
第二阶段
与性腺DNA相互作用的试验 显性致死试验
第一组
第二组
工业生产中应 用或生产的环境 诱变剂
第三组
自然诱变剂与 食品加工过程中 产生的诱变剂
2. 遗传损伤的类型
以DNA为靶
机制
不以DNA为靶 细胞水平
基因突变 染色体结构畸变 染色体数目畸变
显微镜 可见度
分子水平
基因突变
损伤牵 涉范围 染色体突变
碱基置换 移码突变 大段损伤 染色体结构畸变 染色体数目畸变
-9-
基因组突变
DNA链中正常的碱基配对
A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 C:胞嘧啶 G:鸟嘌呤
2. 遗传损伤的类型
2.1 基因突变
基因突变(gene mutation)：基因中DNA序列的改变，又称为 点突变。
A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 G:鸟嘌呤 C:胞嘧啶
碱基置换
转换 A G T C
同义突变：未改变基因产物氨基酸序列 错义突变：引起产物氨基酸序列改变 无义突变：使蛋白质合成中止
颠换 A or G
C or T
2.1 基因突变
移码突变：从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码 子读码顺序的突变。
使基因产物发生大的改变，引起明显 的表型效应，常导致致死性突变
2.1 基因突变
大段损伤：DNA序列上有较长的一段序列的重排分 布，也叫DNA重排。
2.2 染色体突变
染色体突变(chromosomal mutation)：染色体结 构的改变，又称为染色体畸变。 断裂剂(clastogen)：能引起染色体畸变的外源化 学物。 染色单体型畸变 染色体型畸变
SCE试验原理示意图
BrDU掺入 到新合成 的DNA链 BrDU掺入 到新合成 的DNA链
第一次 细胞分裂 BrDU
第二次 细胞分裂 BrDU
SCE交换
遗传毒理学试验可信性评价
实验方法 Ames试验 骨髓细胞染色体畸 变试验或微核试验
灵敏性(%) 17/19 (89%) 18/18 (100%)
2.DNA链结构损伤
(1) 形成嘧啶二聚体 (2) 形成DNA加合物和DNA—蛋白质交联物
3.影响细胞分裂过程 4.对修复酶的影响
激活原癌基因或灭活抑癌基因
致突变因素
原癌基因
化学、物理、生物因素
癌基因 原癌基因点突变 原癌基因扩增 染色体易位与基因重排 原癌基因抑制解除 抑癌基因缺失
抑癌基因
机体对突变的修复
1. 引言
1.3 环境致突变剂 (Environmental Mutagen）
分组 特点
人工合成，仅 在一定条件下应 用的诱变剂
类别
1.药品：抗癌药、抗菌素、麻醉剂和避孕药等 2.农药：杀虫剂、灭鼠剂、除锈剂、除霉剂及其残留物 3.食品添加剂 4.化妆品 5.生物污染 1.工业烷化剂 2.有机溶剂及有机金属化合物 3.水体污染物 4.空气污染物 5.重金属及其化合物 1.生物碱 2.微生物代谢产物 3.食品加工中产生的诱变剂
37℃, 48h
低剂量
受试物
中剂量
大鼠肝微粒 体酶(S-9)
顶层琼脂培养基 混匀
高剂量
Ames试验标准菌株和敏感性 标准菌株 TA97 移码突变 TA98 移码突变 TA100 碱基置换突变 TA102 碱基置换突变、对醛类、过氧化 物及DNA交链剂比较敏感 脂多糖突变(rfa) 增加细胞壁的通透性 uvrB缺失 DNA损伤后修复力降低 R因子 增高诱变率
生态毒理学 (Ecotoxicology)
第六章 环境污染物的特殊毒 性及其评价
主讲教师：刘 薇 大连理工大学 环境学院
一般毒性和特殊毒性
一般毒性

特殊毒性
致突变作用 致癌作用

急性毒性 亚慢性毒性
慢性毒性 蓄积毒性 局部毒性
Leabharlann Baidu
生殖和发育毒性
安全性评价
第一节 环境化学物的致突变性及其评价
代表物：丫啶橙、原黄素等丫啶类染料分子 方 式：以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之 间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间
后 果：移码突变
原黄素
丫啶橙
化合物的致突变机理
1.碱基损伤
致突变物改变或破坏碱基的正常结构。 (1)碱基错配 (2)平面大分子嵌入DNA链 (3)碱基类似物取代 (4)碱基化学结构改变或破坏
1. 引言
1.2 环境致突变作用研究简史
时间 事件 作者
1904
发现X射线可以改变生殖细胞的遗传物质
de Vries
一些氧化剂对细菌和真菌诱变作用的研究
1927 1942 1943 1946-48 1969 用X射线照射发现可以引起果蝇基因突变 发现芥子气可诱发果蝇基因和染色体畸变 发现氨基甲酸乙酯有诱变性 发现环氧乙烷、乙烯亚胺、重氮甲烷、缩水 甘油等具有诱变性 成立国际环境诱变剂学会
妊娠12~14天 剖腹 检查活胎数、早死胎 数、晚死胎数
3w 精子前期
4w 精母细胞后期
5w 精母细胞前期 6w 精原细胞
以小鼠为例
3.6 姊妹染色单体交换试验（SCE)
SCE是指一个同源染色体内，两个染色单体之 间DNA复制产物发生互相交换，可能与染色体断裂 和重接有关。 判断受试物是否具有DNA损伤作用。
1. 引言 2. 遗传损伤的类型 3. 污染物致突变作用机理
4. 污染物致突变的不良后果
5. 污染物致突变作用的评价
环境毒理学 实验
小鼠骨髓细胞微核实验
1. 引言 突变(mutation)是一种遗传状态、可以通 过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。
遗传 1.父、母DNA重组 变异 2.基因突变 3.染色体组成或细胞质变化 突变 诱发突变 自发突变
3.1 原核细胞微生物试验(Ames试验)
利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株，根据 受试物是否诱发沙门氏菌突变型(his－)回复为野生 型(his＋)的形成菌落的能力，测定受试物。
正向突变
回复突变
野生型his+
突变型his— ±代谢活化系统 (S-9mix)
受试物
Ames试验方法
对照组
沙门氏菌突 变型(his－)
隐性 致死
存活 突变
动脉 硬化
未知 疾病
癌 变
老 化
出生缺陷 (流产/死 胎) 癌变
出生缺陷 (功能或 结构畸形)
流产 死产
出生缺陷 基因负荷 先天性疾病
3.遗传毒性检测实验
1 基因突变试验 原核细胞微生物试验 昆虫试验 小鼠基因突变试验 真核微生物试验 哺乳动物体细胞体外试验
2 染色体畸变试验 哺乳动物细胞染色体畸变试验 微核试验 显性致死试验 小鼠遗传易位试验 3 DNA损伤与重组试验 细菌DNA修复试验 程序外DNA合成试验 姊妹染色单体交换(SCE)试验 SOS显色试验(SOS chromotest)
1. 引言
1.1 环境致突变作用(environmental mutagenesis)
自发突变(spontaneous mutation)：自然条件下发生，概率极 低，生物进化的基础 诱发突变(induced mutation)：人为地或由各种因素诱发产生
物理因素
环境致突变作用
化学因素
生物因素
化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变， 可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关
原理
细胞受到诱变剂的作用后，染色体数目和较大范围的结构改 变。在细胞分裂中期，利用光学显微镜下直接观察到这些变化。
体外实验
* 中国仓鼠卵巢细胞 中国仓鼠肺细胞 外周血淋巴细胞
体内实验
小鼠骨髓细胞染色体畸变试验 小鼠睾丸细胞 细胞分裂周期
染色体畸变试验方法
秋水仙素 阻止纺垂丝形成 体外实验 淋巴细胞 培养细胞 体内实验 哺乳动物 受试物 培养基
2.化合物的致突变机理
2.1 DNA加合物和交联分子的形成
(1)大加合物
代表物：多环芳烃、生物毒素、黄曲霉毒素B和芳香胺类 后 果：DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位 DNA的半 保留复制和转录。
苯并(a)芘 (2)小加合物
芳香胺
黄曲霉毒素B
代表物：烷化剂、亚硝基化合物 后 果：对 DNA的构象影响较小，易导致碱基错误配对。 DNA甲基化、乙基化
DNA连接酶 嘌呤插入酶 直接修复 O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶 二聚体光解酶 DNA修复 核苷酸切除修复 碱基切除修复 切除修复 错配碱基修复 复制后修复 呼救性修复
遗传毒性的后果及其形成机制
致突变作用
体细胞突变 生殖细胞突变
良性 肿瘤
恶性 转化
细胞 衰老
分化的 胚胎细 胞受损
未分化 的胚胎 细胞
显性 致死
碱基类似物：与天然碱基的结构非常相似的外源化合物 后 果：引发碱基替代突变
2.3 DNA分子上碱基的化学修饰
亚硝基引起的氧化脱氨反应
NH2OH的致突变作用
作用机制复杂，不同PH、 NH2OH浓度，产 物不同 烷化剂的致突变作用
硫酸二甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基磺酸乙酯、 MNNG
2.4 嵌合剂的致突变作用
微核试验方法
小鼠
腹腔注射 受试物 24h
骨髓 嗜多染RBC
微核出现率 (1/1000)
外周血淋巴细胞微核试验 细胞培养微核试验 植物细胞 非哺乳类动物细胞
3.5 显性致死试验
染毒后交配时期
雄鼠
连续染毒5天 从染毒第一天起经过 一个精子发育周期
（大鼠60天，小鼠35天）
未交配过的雌鼠同 笼5天
1w 输精管和附睾中 的精子 2w 精子后期
Franz&Elizabeth
Mü ller Charlotte&Robson Franzoechlkers Rapoport
遗传毒理学(Genetic Toxicology)
化学性和放射性因素的致突变作用和机理、对人
类接触致突变物引起的健康效应和预防措施的科学。
研究内容 1. 潜在的致突变作用
2. 致突变作用机制 3. 建立新的检测方法 4. 评价致突变物对人类健康的威胁
经口或腹 腔注射
处死前2-4h 腹腔注射
中期相细胞
骨髓，睾丸细胞
染色体数目 结构
•急性试验 染毒一次 •亚急性试验 连续染毒5天 •慢性实验 连续染毒3个月
染色体畸变
染色体结构异常
裂隙、断裂、缺失、 微小体、着丝点环、无 着丝点环等
数目异常
多倍体或非整倍体
3.4 微核试验
在致突变剂作用下，染色体损伤产生的无着丝点染色体断片 和环，在细胞分列时不能定向移动进入细胞核，残留在细胞质 中。微核的着色和细胞核相同，比正常细胞核小。 本试验可以检测受试物的染色体断裂作用和非整倍体诱变作用。
2.2 染色体突变
a染色单体断裂
b三辐射体
c.染色体断片
d. 双着丝点染色体 e. 环状染色体 f-g. 无着丝点断片
2.3 基因组突变
基因组突变(genomic mutation)：基因组中染色 体数目的改变，又称为染色体数目畸变。
类型 整倍体 单倍体 二倍体 三倍体 四倍体 非整倍体 单体 三体 四体 双三体 缺体 公式 染色体组