第九章 生物技术在林木育种中的应用

2. 数量性状位点定位(QTL)
数量性状位点是指与一定标记连锁或相关，且影 响某一数量性状的染色体区域。随着分子标记技术的 发展，产生了多种基于单标记、区间标记和多标记的 定位QTL的统计模型和计算机软件，QTL定位研究随之 快速发展。
对数量性状位点(QTL)，如：对树高、树形、材 性、物候和各种抗性性状位点进行定位，可进行育种 策略和标记辅助选择育种研究，加速树木改良的过程。 我国已开展了美洲黑杨×青杨叶部特征、高和径生长、 物候等数量性状位点定位研究。
别定位在连锁图谱上。
另外，利用分子标记分析找到了南抗杨
(P.deltoides Bartr.cl.‘Nan Kang’)新品种抑制害虫的
物质和与抗虫相连锁的标记，为杨树抗虫育种的可行性 提供了依据。
4. DNA指纹图谱绘制及品种鉴定 指纹图谱指能够反映生物个体间差异的电泳图谱，
它具有类似于人的指纹那般的高度个体特异性和稳定
第九章 生物技术在林木育种中的应用
主要内容
组织培养原理和方法 体细胞突变与筛选
原生质体融合
基因工程育种
分子遗传标记
常规育种与新技术育种的结合
一. 组织培养原理和方法
组织培养是生物技术的一个基本技术。 植物组织培养就是从植物体上取下某一器官 或组织，在人工培养基上分化、再分化，最 后长成完整植株的过程。
再生植株(ck2) 诱导
愈伤组织(ck1)
多代无选择扩繁 抗性愈伤组织 抗性稳定性测定 （设ck3）
a.抗性测定 b.细胞学鉴定 设ck2 c.生理生化鉴定 d.分子鉴定
三. 原生质体融合
1. 概念 把两种生物的体细胞相互融合，使 它们的细胞核和细胞质都彼此结合在一 起，形成杂种细胞，从而有可能育为新 的个体，它是一种无性杂交的方法，也 称为体细胞杂交。
2.基于PCR技术的分子标记 1）单引物PCR标记
RAPD（Random Amplified Polymophismic DNAs）
SPARS(Single Primer Amplication Reactions) SSR-锚定PCR
2）3｀端具有选择性的双引物PCR标记 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）
全身散发荧光的转基因鱼
紫 色 转 基 因 石 竹
山羊会吐蜘蛛丝
转基因荧光猪
转基因的小鸡
五. 分子遗传标记
－遗传标记包括： 形态标记、细胞学标记、生化标记、DNA分子标记。 －分子标记是物种表现型在分子水平上遗传多态性的直接 映射，分子水平的遗传多态性表现为 DNA 核苷酸序列的差异。

分生组织实现细胞全能性的途径
–由分生组织直接分生芽而达到快速繁殖的目的 –由分生组织形成愈伤组织，经过再分化 –游离细胞或原生质体形成胚状体，由胚状体直接
重建完整植株、或制成人工种子后再重建植株
叶肉组织
愈伤组织
新植株
快速无性繁殖
二. 体细胞突变与筛选
随着植物细胞与组织培养技术的发展，使高 等植物具备微生物的实验操作特性，可把植物细 胞作为试验系统。在较小的控制环境中，处理大 量有机体，选择我们所需的突变体。进而，可利 用植物细胞的全能性，把选择的细胞突变体与性 状的改进联系起来。
– 愈伤组织，单细胞、原生质体，最好是单倍体细胞
另外，还可利用离体器官，如：茎尖、茎段
2. 突变体的选择 分离抗体突变体的直接选择法：
把大量的细胞置于含抑制生长的化合物
的培养基上，使亲本细胞不能生长，而具抗 性的细胞才能生长，这样就可把生长的抗性 细胞分离出来。
3. 林木中的应用
杨树、黑荆树、东北红豆杉(细胞培养、杨 树体细胞胚胎发生、耐盐体细胞突变体筛选等研 究。首次在林木中建立了群众杨39号悬浮细胞系， 利用逐步加大培养基中的NaCl浓度的方法，获得 群众杨39号耐盐体细胞变异体植株，开始大田试 验和分子检测。另外，从红豆杉的叶片诱导出愈 伤组织，对愈伤组织培养、细胞克隆的培养以及 细胞悬浮培养进行了研究，并获得较高生长量的 紫杉醇体细胞培养物。
可靠性。各种DNA分子标记均可用作DNA指纹图谱分析， 其中微卫星和AFLP标记更为理想，因为它们所提供的 多态性信息更为丰富。利用DNA指纹图谱可进行品种 鉴定、鉴定品种真实性和纯度、确定品种的亲缘关系，
3）基于特异双引物PCR的标记 小卫星DNA、微卫星DNA
Fra Baidu bibliotek
序列标志位点（STSs）
CAPS等。
SSR又称微卫星，是指以少数几个核苷酸（多为2~4个） 为单位多次串联重复的DNA序列。在真核生物中大约 每隔10~50kbs就存在一个微卫星，且在基因组中的分 布是随机的，不仅可以存在于内含子中，也可存在于 编码区及染色体上的其他任何一区域。微卫星分析的 关键在于开发基因组中微卫星两侧的引物序列。
胞质融合
胞壁再生 杂种细胞 杂种愈伤组织
植 物 细 胞 杂 交 程 序
诱导分化 杂种植株
2. 体细胞融合在树木改良中的优势
1）可克服远缘杂交不亲和 2）能获得某一亲本的非整倍体杂种和细胞质杂种
3）一次能设计两个以上亲本遗传物质的融合
4）能获得遗传上呈双亲基因总和的杂种
3. 林木中的应用
我 国 从 1990 年 开 始 ， 相 继 报 道 毛 白 杨 (P.tomentosa Carr.) 、 悬 铃 木 (Platanus acerifolia (Ait.) Willd.) 、 白 花 泡 桐 (Paulownia fortuneii (Seem.) Hemsl.) 、 桑 树 (Morus alba L.) 、小叶杨等树种原生质体培养获 得再生植株，为体细胞杂交、外源基因导入创造了 良好条件，还获得小叶杨及美洲黑杨×小叶杨F1杂 种原生质体培养的再生植株。
河北杨体细胞抗 盐性突变体离体 筛选程序 耐盐性鉴定
外植体
诱导
愈伤组织
扩繁
生长进程测定 确定诱变剂半致死剂量 扩繁 同步 扩繁 化学诱变 愈伤(ck3) 再生
愈伤组织 愈伤组织
利用自发突变 抗性愈伤组织的分离 抗性愈伤组织 选择扩繁 抗性愈伤组织
物理诱变（Co60）
直接在选择分化培养基
非选择培 养基成苗 不定芽 选择或非选择培养基 试管苗 无性系扩繁 抗性无性系试管苗 诱导 次生愈伤组织 抗性稳定性测定 （设ck1）
1. 诱变处理
突变可分为自发突变和诱发突变。自发突变 的频率很低，为10-5一10-8，诱变剂处理，可提高 10一100倍。
（1）诱变因素 物理因素
– 紫外线、X射线、γ射线、β射线和中子射线等
化学因素
– 亚硝基脲，甲基磺酸乙酯（EMS），乙烯亚胺，5一溴
尿嘧啶等
（2）诱变因素的剂量及诱变所用材料 剂量 处理后存活率达一半左右的剂量为宜 材料
－分子标记大多以电泳谱带的形式表现，可分为以
Southern杂交技术为核心的分子标记和以PCR技术为核心的分 子标记。另外，由于其中有些 DNA 标记和重复序列密切相关， 有时将这种直接源于重复序列的标记单独出来，以突出其独特 性。
（一）分子标记的种类
1. 基 于 Southern 杂 交 技 术 的分子标记 RFLP （ Restrictiong Fragment Length Polymorphisms）: 限制性片段长度多态性。
组织培养的原理就在于细胞的“全能 性”。 “全能性”是指离体的植物体细胞或性 细胞（花粉）在一定培养条件下，能被诱导 发生器官分化和再生植株的能力，而且再生 植株具有与母体植株相同的全部遗传信息。

具有全能性的细胞
–受精卵（合子）
–发育中的分生组织细胞（包括有幼嫩器官的细胞） –雌、雄配子及单倍体细胞
（二）分子标记的应用
1.遗传连锁图谱的构建 遗传连锁图谱的构建是分子遗传学研究中 一个有划时代意义的领域，是对基因组进行系 统研究的基础，是在分子遗传学基础上强化动 植物育种的依据，也是林木育种和基因转导的 有力工具。目前，我国在林木遗传连锁图谱研 究方面进展较快，已相继成功地构建了马尾松、 美洲黑杨×青杨 (P.cathayana Rehd.) 、银杏 (Ginkgo biloba L.)的中、低密度遗传连锁图 谱。目前，正在利用多种标记方法构建高密度 遗传连锁图谱。
其它
– 获得了泡桐转基因植株，为培育抗泡桐属大袋蛾 (Clania
variegata Snellen)无性系提供了可能。 – 开展了利用根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 和发 根农杆菌 (Agrobacteroum rhizogenes) 马尾松转化试验， 建立了松树的转化系统等。
3. 标记辅助选择(MAS)
利用与目的基因位点连锁的标记进行标记选择，
为林木早期测定提供了可能，同时也提高了早期测
定的精度和可靠性，从而大大缩短了选种周期。 目前，标记辅助选择研究多集中于抗病性状。 利用分子标记鉴定选择抗病基因的优势在于提供了 一种不依赖于人工接种鉴定选择抗病基因的手段，
尤其对同时鉴定具有多个抗病基因的杂交后代个体
在杨树育种中
– 将苏云金杆菌 (B.t.) 杀虫蛋白基因导入欧洲黑杨 (P.nigra
L.)，成功获得欧洲黑杨转B.t.基因抗虫植株 – 将 B.t. 基因和马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 的胰蛋白酶 抑制剂基因导入毛白杨 (P.tomentosa Carr.)及美洲黑杨× 小叶杨 (P.simonii Carr.cv.‘NL-80121’)F1 杂种中，获得一 批转基因植株； – 利用 ACC 合酶反义基因转化美洲黑杨获得成功，研究证明 ACC合酶反义基因能有效地抑制其乙烯的释放； – 抗盐转基因杨树也获得了成功。
（2）DNA与DNA杂交法（Southern Blot） （3）DNA与RNA杂交法（Northern Blot）
5. 林木中的应用
林木遗传转化研究始于 80 年代中期，目前， 国际上已获得转基因树种达 20 余种，包括毛果 杨 × 美 洲 黑 杨 (P.trichocarpa Torr.et Groy.×P.deltoides Marsh.) 、 白 云 杉 (Picea glauca (Moench) Voss.) 、 火 炬 松 (P.taeda L.) 、 兴 安 落 叶 松 、 花 旗 松 (Pseudotsuga menziesii (Mirbel) Franco) 等。涉及到的基 因有抗病虫、耐盐碱、抗旱、抗除草剂及木材 品质改良等。
3. 选择标志基因
标志基因的作用就是为了能够轻易地将转化的 细胞和非转化的细胞区别开来。并使转化细胞再生 出植株。 选择和应用一个好的标志基因是植物基因转化 成功的一项技术关键。一般都是人工加工的嵌合基 因，由启动子、结构基因和终止子组成。
4. 基因的表达分析和鉴定 （1） GUS测定
根据β一葡糖苷酸酶可以分解很多β 一葡糖苷酸，这些底物被切割后会发出荧 光或使植物组织成为蓝色。被GUS基因转化 的材料应具有蓝色。
1、从胚性 愈伤组织分离的 原生质体。 2、培养4天 后再生细胞进行 第一次分裂。
3、培养约 三星期的小愈伤 组织。 4、分化的胚 芽鞘。
玉米原生质体植株再生
5、分化的小 植株。
小 偃 麦 原 生 质 体 植 株 再 生
起源细胞 细胞壁降解 亲本原 生质体 诱导融合 聚集、粘连
异核体 培养
核融合 选择
具有接种鉴定无法代替的作用。
在林木抗病质量性状研究中，主要对青杨锈病
(Melanpsora laricis-populina Kleb.)、松树疱锈病 (Cronartium quercuum (Berk.) Miyabe ex.Shirai f.sp.fusiforme)、榆树黑斑病(Stegophora ulmea)基 因研究较多，现已找到与这些病紧密连锁的标记，并分
四. 基因工程育种
1. 基因工程概念 也称重组DNA技术，是现代生物技术的核心。 以类似工程设计的方法，将带有目的基因的
DNA片段在离体条件下，用工具酶加以剪切、 组合和拼接（重组DNA），再将这种重组的 基因引入适当的受体中进行复制和表达，使 受体获得产生该基因产物的新性状
2. 步骤
（ 1） （ 2） （ 3） （ 4） （ 5） 获得“目的”基因 载体构建及目的基因与载体重组 导入受体 筛选转化细胞 鉴定