代谢组学技术

最早的核磁共振成像实验是由1973年劳 特伯发表的，并立刻引起了广泛重视，短短 10年间就进入了临床应用阶段。人体组织中 由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的 氢核，一般用氢核得到的信号比其他核大 1000倍以上。正常组织与病变组织的电压 信号不同，结合CT技术，即电子计算机断层 扫描技术，可以得到人体组织的任意断面图 像，尤其对软组织的病变诊断，更显示了它 的优点，而且对病变部位非常敏感，图像也 很清晰。
2 代谢组学化学分析技术
代谢组研究需要比较复杂的分离、鉴定方 法, 到目前为止, 应用的方法主要包括核磁共振 （nuclear magnetic resonance，NMR)、电 喷 雾 电 离 质 谱 (electrosprary ionization mass spectrometry, ESI-MS)、液相色谱-紫 外 光 谱 - 质 谱 联 用 (liquid chromatography ultraviolet massspectrometry, LC-UV-MS)、 串 联 质 谱 (tandem massspectrometry, tandem MS)以及液相色谱-质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry, LCMS)等。
第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯·阿 斯顿于1919年制成的。出手不凡，阿斯顿用 这台装置发现了多种元素同位素，研究了53 个非放射性元素，发现了天然存在的287种 核素中的212种，第一次证明原子质量亏损。
他为此 荣获1922年诺贝尔化学奖。
质谱仪种类非常多，工作原理和应用范围也 有很大的不同。从应用角度，质谱仪可以分为 下面几类： 有机质谱仪： ① 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS） ② 液相色谱-质谱联用仪（LC-MS） ③ 其它有机质谱仪，主要有：基质辅助激光 解 吸 飞 行 时 间 质 谱 仪 （ MALDI-TOFMS ） ， 富立叶变换质谱仪（FT-MS） 无机质谱仪： ① 火花源双聚焦质谱仪 ( SSMS ） ② 感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS） ③ 二次离子质谱仪（SIMS）
代谢组学技术
及其在医学研究中的应用
系统生物学（systems biology） 是研究一个生物系统中所有组成成 分 （ 基 因 、 mRNA 、 蛋 白 质 等 ） 的构成，以及在特定条件下这些组 分间的相互关系的学科。
在后基因组(post-genome)时代, 系统生物学研究逐渐成为人们关注 的焦点。系统生物学研究的目的是 根据细胞内基因、蛋白质、代谢物 以及细胞器等组分间的时空相互关 系构建生物网络, 了解生物行为。
1946年，美国哈佛大学的珀塞尔和斯坦 福大学的布洛赫宣布，他们发现了核磁共振。 两人因此获得了1952年诺贝尔奖。核磁共 振是原子核的磁矩在恒定磁场和高频磁场 （处在无线电波波段）同时作用下，当满足 一定条件时，会产生共振吸收现象。核磁共 振很快成为一种探索、研究物质微观结构和 性质的高新技术。目前，核磁共振已在物理、 化学、材料科学、生命科学和医学等领域中 得到了广泛应用。
基质辅助激光解吸附飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS）
傅立叶变换离子回旋共振质谱仪
A FT-ICR mass spectrometer
质谱仪的基本结构及工作流程
单聚焦质谱仪示意图
氰戊菊酯的结构及其质谱图
近来, 两种新质谱技术傅立叶变换回旋共振 质 谱 (Fourier transform ion cyclotron resonancemass spectrometry, FTICR-MS) 和 毛 细 管 电 泳 质 谱 (capillary electrophoresis mass spectrometry, CEMS)被用于代谢物图谱分析。FTICR-MS 具有 高通量的优点, 可检测上千种代谢物, 但不能区 分异构体限制了它的应用; CE-MS 检测灵敏度 较高, 可以检测低丰度代谢物, Soga 等利用
代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官 的生化状态, 协助阐释新基因或未知功能基 因的功能, 并且可以揭示生物各代谢网络间 的关联性, 帮助人们更系统地认识生物体。 进行代谢组学研究涉及生命科学、分析科学 以及化学统计学三大方面的专业知识。 代谢 物化学分析技术及数据分析技术的发展极大 促进了诸多生物、医学问题的研究, 这些知 识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、 药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极 为重要的作用。
HPLC图谱
Liquid chromatography-mass spectrometry
气相色谱
gas chromatography
气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。 由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分 在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。 另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相 色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离 分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器， 使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优 点。
CE-MS 在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中
检测到一千多种代谢物。
质谱谱图数据库收录了大 部分常用化合物的质谱数据， 检索途径为质荷比检索，丰度 检索以及组合检索，可获取化 合物质谱谱图，物化性质等信 息。
高效液相层析
High performance liquid chromatography
一些组学研究技术的发展极大地推动了系统 生物学的研究, 比如转录组学 （ transcriptomics ） 、 蛋 白 质 组 学 （ proteomics ） 等 功 能 基 因 组 学 （ functional genomics, 与 结 构 基 因 组 学 structural genomics相对 )研究方法可同时检测药物、疾 病、环境或其它因素影响下大量基因或蛋白质的 表达变化情况, 但这些变化往往不能与生物学功 能的变化建立直接联系。代谢组学 (metabonomics／metabolomics)方法则可为代谢
ATRP 聚酯大分子引发剂的300M核磁共振氢谱
核磁共振波谱查询数据库
系统数据库包含化合物核磁共振氢谱 6万多张，核磁共振碳谱4万多张．可通 过光谱编号、原子数、分子式进行查询， 结果得到所要查询化合物的有关信息及 其标准谱图．系统程序还允许用户将本 研究领域一些常用化合物的标准谱信息 和图谱添加进数据库以供日后查询．
核磁共振仪器组
早期核磁共振主要用于对核结构和性 质的研究，如测量核磁矩、电四极距、 及核自旋等，后来广泛应用于分子组成 和结构分析，生物组织与活体组织分析， 病理分析、医疗诊断、产品无损监测等 方面。用核磁共振法进行材料成分和结 构分析有精度高、对样品限制少、不破 坏样品等优点。
对于孤立的氢原子核（也就是质子），当磁 场为1.4T时，共振频率为59.6MHz，相应的 电磁波为波长5米的无线电波。但在化合物分 子中，这个共振频率还与氢核所处的化学环境 有关，处在不同化学环境中的氢核有不同的共 振频率，称为化学位移。这是由核外电子云对 磁场的屏蔽作用、诱导效应、共厄效应等原因 引起的。同时由于分子间各原子的相互作用， 还会产生自旋-耦合裂分。利用化学位移与裂 分数目，就可以推测化合物尤其是有机物的分 子结构。这就是核磁共振的波谱分析。
乙氧氟草醚GC-MS质谱图
采用何种分析技术主要取决于待分析生物 系统的种类以及要解决何种科学问题。NMR
可以快速、无损伤性地进行代谢物的体内(in vivo)或体外(in vitro)比较分析。直接应用
MS进行代谢物分析虽然速度也较快, 但具有 灵敏度以及分辨率较低的缺点。将MS与GC 或LC联用(GC-MS 或LC-MS), 虽然降低了分 析速度, 但却提高了分析灵敏度以及分辨率。 而且基于质谱的分析技术已长期用于代谢物 指纹图谱分析,具有比较成熟的样品制备、数 据采集以及分析等操作程序。
质谱分析(mass spectrometry, MS) 是一种测量离子荷质比（电荷-质量比，
charge-mass ratio）的分析方法，其
基本原理是使试样中各组分在离子源中发 生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离 子，经加速电场的作用，形成离子束，进 入质量分析器。在质量分析器中，再利用 电场和磁场使发生相反的速度色散，将它 们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质 量。
物含量变化与生物表型变化建立直接相关性。
代 谢 组 (metabolome) 是 指 一 个 细 胞 、 组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一 系列不同化学型的分子, 比如肽、碳水化 合物、脂类、核酸以及异源物质的催化 产 物 等 。 代 谢 组 学 (metabonomics ／ metabolomics)来源于代谢组一词,是研究 一个细胞、组织或器官中所有小分子代 谢组分集合的科学。代谢组学研究的目 的是定量分析一个生物系统内所有代谢 物的含量。
1 代谢组学分析实验设计及样品制备
代谢组学是一种大规模研究技术,对于 研究外源性物质(药物或毒物)刺激、环境 变化或遗传修饰引起的机体所有代谢物 变化过程是很有效的, 比如寻找疾病生物 标志物用于早期诊断。但对于研究特定 种类的代谢物, 这种大规模研究平台的灵 敏度则不如传统的技术手段。
进行代谢组分析, 首先需要进行样品的 提取。对于组织和细胞培养液, 水相和有机相 代谢物可以很容易地被提取。实际上, 不论各 种代谢物在体内参与何种代谢过程, 通过相应 抽提程序, 所有的胞浆以及膜代谢物均会被提 取出来。样品制备过程的不一致性导致结果 重复性较差。因此, 为最大程度减小操作对代 谢组数据产出的影响, 人们应严格遵循一套标 准 的 提 取 程 序 (Standard Operating Protocols, SOPs)。
70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵， 压强最高可达34个标准大气压。用直径约3～10微米的超 细支持物装填均匀的不锈钢柱。这种支持物能承受很高 的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可 做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微 量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样 品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速 度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥 发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者 互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC在生物化 学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
1.乙醛
2.甲醇Leabharlann Baidu
6.仲丁醇 7.异丁醇
11.异戊醇 12.丁酸乙酯
16.己酸乙酯
3.乙醇 8.乙缩醛 13.丙酸
4.正丙醇
5.乙酸乙酯
9.正丁醇
10.乙酸
14.乳酸乙酯 15.丁酸
白酒分析：GC
A gas chromatograph (right) directly coupled to a mass spectrometer (left)
代谢组数据的分析离不开化学统计学的应用。 在利用NMR 和MS 进行的代谢组学研究中, 化 学统计学是指利用数学或统计工具进行光谱处 理、峰比对、异常值检测以及数据均一化等。 多变量分析是分析代谢组研究产出的复杂数据 的 一 种 有 效 方 法 , 其 中 PCA(principal
component analysis，主成分分析)是一种将
3 代谢组学数据采集与分析
与转录组、蛋白质组研究一样, 代谢物可以 通过与对照样品的比值进行相对定量。通过添 加标准参照物以及对代谢物进行同位素标记, 可以获得绝对定量的代谢组数据集。此外, 数 据采集的重复性以及采用何种数据处理方法对 代谢组分析结果的影响很大。
一旦获得代谢组的定量数据集, 可以采用 已在转录组、蛋白质组分析中得到应用的多 种数据分析策略进行代谢组数据分析, 这些 分析策略的基本原则是比较实验组与对照组 之间代谢物水平差异,并利用统计方法评估这 些差异的显著性。