临床微生物基础操作规程

& SXT 纸片
#2
#3
接种环
#4
在第一区贴相邻的两纸片：复 方磺胺和杆菌肽
将拭子擦拭血平皿（羊血 或马血）的1/5区域
分区画线3或4区
#5
在烛缸中37° C孵育过夜并检查 平板；若阴性，继续孵育 过夜 总孵育时间＝48小时
#8
报告结果：
1+ to 4+ A群β溶血链球菌 或 1+ to 4+ 非A群β溶血链球菌 或 未检出β溶血链球菌
男性
所有
所有 所有
•革兰阴性杆菌在血平 皿和麦 康凯平皿上均 生长良好 •革兰阳性球菌仅在血 平皿上生长良好
GNR
50,000 cfu/ml
75,000 cfu/ml
尿培养的评估标准
标本类型 清洁留取或留置管留 取 清洁留取
清洁留取
清洁留取
从导尿管中直接留取
外科或膀胱吸取 有争议
#5
若≤ 2 种菌生长，对 每种菌进行鉴定和药 敏试验；
和变形杆菌
B群β溶血链球菌（GBS)， 仅为孕妇报告
#2
30 min内将拭子置于0.5ml生 理盐水中检测滴虫
将拭子在玻片上滚 动制成一个细胞厚 度的涂片；寻找 “线索细胞”
4
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
脓，吸取物或组织标本
主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他β溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆 菌。 非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌
临床微生物基础操作规程
Ellen Jo Baron 教授
美国斯坦福大学临床微生物室主任 "Manual of Clincal Microbiology"细菌学卷主编 ASM"Blood Culture"联合主编
血培养 ................1 脑脊液培养 .............2 粪便培养 ..............3
7
Urine Culture尿培养
主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐 生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌
a
b
#2 接种血平皿和麦康凯平
皿
a
b
0.001ml接种环
#3
#1 收集中段尿
注意:
GP C GPC
空气孵育24小时
#6
病人 无症状
有症状但不需 卧床 有症状，性生 活活跃的女性
杆菌肽
#9
不要报告
咽炎中非致病菌：
• • • • • • •
复方 磺胺
金黄色葡萄球菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 卡他莫拉菌
α溶血链球菌 所有革兰阴性杆菌 所有酵母菌
#7
PYR阳性可确证 A群链球菌
#6
β溶血菌落， > 0.5 mm, 对复方磺 胺耐药，对杆菌肽敏感＝A群链球 菌（触酶阴性）
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
T—M培养基上寻找淋球菌， 血平皿上寻找酵母菌
C. 怀孕35-37周的孕妇阴道 或肛拭子
# 1 营养肉汤中
孵育过夜
D. 女性的阴道拭子
#2
血平皿上次代培养检测
B群链球菌
非病原菌
#1
血平皿上寻找 酵母菌， T-M培养基上寻 找淋球菌
革兰染色辅助诊断细菌 # 1 性阴道病
金黄色葡萄球菌
任何革兰阴性杆菌，包括大肠杆菌
.如果为组织，在无菌的小盘上将 #2 其捣碎，然后在含硫肉汤中将其 研磨成匀浆
#1
•用酒精消毒皮肤后或者在手术时 采集标本 •将抽吸物或组织置于厌氧转运小 玻璃瓶中 •拭子不能用于厌氧培养 •将体液置于血培养瓶和ACD管中
#3
•将研磨后的组织接种于BAP, Mac, Bru, BBE, CM肉汤, & LKV (可选择) •革兰染色&将重要结果报告 给医生
金黄色葡萄球菌
奥普托欣＋
#5
对重要病原菌进行 鉴定&药敏试验
肺炎克雷伯菌
#4
CO2中孵育 48小时
流感嗜血杆菌
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attrib ution
6
咽部标本培养
杆菌肽
#1
拭子
拭子擦取咽部和 扁桃体。不要碰 触舌头和面颊。
主要病原菌：A群β溶血链球菌。 选择性报告：溶血隐秘杆菌
若>2种菌生长，报 告“混合菌群”
100,000 cfu/ml
有意义的病原菌 CFU/ml 100,000
1-2 种病原菌。>2 种视为污染
100 纯培养的肠杆菌科菌
1000 潜在病原菌
100 个所有种类的潜在病原菌
任何数量（肉汤增菌，厌氧菌） 任何酵母菌
#4
菌落计数
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
需氧培养时当3或更多的肠道细菌生长，报告“混合细菌生长”，并且描述性 的列举假单胞菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、肠道革兰阴性杆菌 10 © Ellen Jo Baron 2009; Use with proper attribution
纸片扩散药敏试验（K-B法）
用于葡萄球菌，肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌，肠球菌， 和其他在MH平板上35°C空气中培养生长良好的菌
18小时后传进行次代培养 当培养瓶显示细菌生长时进行 革兰染色和传代培养
35°C 空气中孵育5天 每天检查浊度并翻转培养瓶
革兰阳性球菌→接种血 平皿＋奥普托欣试验
#6
对重要病原菌 进行鉴定 和药敏试验 例如：肺炎链球菌 革兰阴性杆菌→接种血平皿和 麦康凯平皿
#4
CO2中孵育 72h
#5
将重要的革 兰染色结果 尽快通知临 床医生
非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌
病人需用水清洁口腔， 深咳肺部痰， 不要唾液
肺炎链球菌
#1
• 进行革兰染色以评价标本是否适于接 种。 • 向临床医生尽快报告重要的革兰染色 结果
#2
拒绝：大量 扁平 上皮细胞
好：很少扁平 上皮细胞
奥普托欣纸片
胆汁溶菌＋
#3
接种巧克力平皿，血 平皿和麦康凯平皿
#1
•用酒精消毒伤口 周围皮肤 •最好的标本是吸取物和组织 •最差的标本是拭子
#2
•接种血平皿和麦康凯平皿 •如果是吸取物或组织，进行 革兰染色，将重要结果通知 临床医生
中孵育48小 时
#3
#5
当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并 描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道 革兰阴性杆菌等。
药敏试验 ..............11
血培养
主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌 以下菌应视为非病原菌(除非>1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌
#3 #2 #1
从两个独立的皮肤位点采血，每瓶 采集10ml
主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群β溶血链球菌
A. 女性的子宫颈或肛拭子
B. 男性的尿道拭子
#1
血平皿& Thayer-Martin平皿
# 1 接种Thayer-Martin培养基&革兰染色
T-M培养基上的淋球菌
血平皿上的酵母菌
#2
CO2中孵育48小时
CO2孵育72h
© Ellen Jo Baron 2008; Use with proper attribution
9
抽吸物和组织标本的厌氧培养
主要致病菌: 金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、其他ß-溶血链球菌、铜绿假单胞菌、其他革兰阴性杆 菌、 梭状芽孢杆菌、 梭菌属、拟杆菌属、其他厌氧菌 非致病菌: 凝固酶阴性葡萄球菌、少量棒状革兰阳性杆菌
肺炎克 雷伯菌
#4
对1或2种 重要病原菌进行鉴定&药 敏试验
β溶血链球菌
金黄色葡萄球 菌为主
混合的2种肠道革兰阴性 杆菌：2种均报告；
铜绿假单 胞菌
5
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
痰标本
主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。
Campy琼脂
革兰染色显示弯曲或螺旋形 的杆菌
弯曲杆菌属
氧化酶阳性、湿润 的米色菌落
#5
血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性 杆菌需进一步鉴定
将菌落接种TCBS或含0-6％盐浓 度的肉汤中。
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
3
生殖道标本培养
如果运输时间超过 2 小时，使用 Cary-Blair 培养基（培养沙门菌 & 志 甘油缓冲的盐水最适于霍乱弧菌 贺菌）
如果运输时间超过 2 小时，使用含碳 可 在 床 旁 直 接 接 种 于 Thayer的 Amies 或 Stuart’s 培养基 Martin 培养基
如果运输时间超过 8 小时，使用 Amies 或 Stuart’s 培养基
无－肺炎链球菌在 2 小时内死亡
A 群链球菌在干燥环境下生长良好。 或使用 Stuart’s 培养基
如果运输时间超过 2 小时，冷藏保存
可以使用特制的硼酸管
生殖道标本
脓
痰
咽
尿
冷藏保存不会检出肺炎链球菌
体液－特别是滑液 如果清亮且无脓，床旁直接注入血培 关节液中的吞噬细胞很活跃，可 （关节液） 养瓶 在几小时内杀死细菌
8
真菌培养
重要病原菌：新型隐球菌，人芽囊原虫 ，皮肤癣菌，和 其他真菌（考虑标本来源和病人情况）
#1
重要的真菌：组 织活检，痰，脑 脊液，血培养
皮肤癣菌：皮肤 刮片，指甲刮片 ，根部的头发
不要研磨组织： 使用解剖刀将其 切成小块
#3
常规：接种沙氏平皿和 Mycobiotic培养基。 30° C 空气孵育四周。
最少1ml，最佳>5ml
#2
1500×g离心15分钟 （可能的话）
#7
将一大滴沉淀 滴在玻片上。 不要涂开。 自然干燥并进行革兰染色。 如见到大量多形核白细胞则 强烈支持感染
用吸管吸去 上清，留下 1cc的脑脊液沉淀
#3
#6
CO2中孵 育72小时
注意：不要倾倒
#5
滴一滴沉淀 于巧克力平皿和 血平皿
#4百度文库
接种血平皿，麦康凯平皿，Hektoen 或DCA，若怀疑弧菌则还接种TCBS 平皿。37 ° C 空气孵育48h
#2
选择血性或脓性的部 分进行接种
#4
麦康凯、HEK或DCA平皿上不利用乳 糖的革兰阴性杆菌需进一步鉴定。
#6
将菌落接种至Campy琼脂 或使用滤纸法。微需氧环 境下37-42° C 孵育 72 h
对于皮肤癣菌：接种 Mycobiotic和DTM培养基
组织，皮肤刮取物或指甲：将 一小块完整的标本插入琼脂表 面
#2
拭子仅用于酵母菌的分离 －接种血平皿和沙氏平皿
#4
#6
接种后7天内每日观察平皿 ，之后每周两次
光滑菌落＝酵母菌 毛状菌落＝丝状真菌
用通气胶带粘贴平皿的侧面 或两边
#5
将标本研于一滴 10%KOH，加盖玻片后 镜检真菌
•细胞离心机离心 体液
#5
卡那霉素 万古霉素 粘菌素
重要厌氧菌进行鉴定&药敏试验
#4
#6
接种平皿、革兰染色和厌氧菌专门 的药敏试验
•在CO2孵箱中将 BAP & Mac 孵育 48小时 •在厌氧环境中孵 育5天（不要暴露 于空气中48小 时）
巧克力琼脂-置于 CO2孵箱
Bru agar – anaerobic 布氏琼脂-厌氧菌
标本类型
血
脑脊液
粪便
运输培养基
直接将标本注入含 SPS 的血培养基
无－室温保存
备注
从两个不同的部位采集足量的两 份血（每份血最少 10ml）
大于 1ml 需要离心
生殖道标本培养 ........4 脓，吸取物或组织标本 ..5 痰标本 ................6 咽部标本培养 ..........7 Urine Culture尿培养 ....8 真茵培养 ..............9 厌氧培养 ..............10
革兰阴性双球菌或球杆 菌→接种巧克力平皿和 血平皿
例如：肺炎克雷伯菌 © Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
1
脑脊液（CSF)培养
主要病原菌：B群β溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童）， 肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌
#1
医生通过无菌皮肤 穿刺采集脑脊液 （腰椎穿刺）于无 菌管中。第二管和 第三管用于微生物 学检测。
上下吸取 10次以上 混匀沉淀
2
© Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution
粪便培养
重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在 常规的实验室可能检测不出）
#3
#1
粪便标本采集后30 分钟内进行接种或 置于cary-blair运输 培养基中
#1
血平板要优于麦康 凯，避免不同的细菌 混在一起
#2
将菌落混匀于 5ml的生理盐水 中制成淡的、均 一的悬浊液
Draw lines on card