高效液相色谱的发展与展望

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【摘要】高效液相色谱(HPLC)是一种快速有效的分离工具。本文主要介绍高效液相色谱的理论基础、基本装置，和在生化制药方面的应用，并对高效液相色谱的最新发展作了展望。

【关键词】高效液相色谱；应用；展望

天然有机物和生物化学研究工作中经常遇到的一个问题是如何从极其复杂的、含量甚微的产物中分析和分离各种产品。随着科学的进步，某些关系到人们生命安全的生物药品，尤其是注射药品和基因工程产品等，都需要高度纯化；生物活性物质的定量定性在新药开发中占有相当大的比重。但是经典的分离方法，如萃取、结晶等单元操作很难满足药品的生产和商业要求。色谱技术的出现和快速发展使之成为了生物制品纯化和生化物质分析的关键单元操作。高效液相色谱对分离样品的类型具有非常广泛的适应性，样品还可以回收。由于对挥发性小的或无挥发性、热稳定性、极性强，特别是那些具有某种生物活性的物质提供了非常合适的分离分析环境，因而广泛应用于生物化学、药学、临床等。目前它已经成为人们在分子水平上研究生命科学的有力工具。从无机化合物、有机化合物到具有生理活性的生物大分子物质，高效液相色谱都具有可观的分析分离能力。

1. 基础理论

从色谱技术的出现以来，人们对色谱理论进行了不懈的研究，提出了许多著名的理论。比如：

1.平衡色谱理论。1940年由Wilson 提出，该理论认为在整个色谱过程中，组分在流动相和 固定相之间的分配平衡能瞬间达成。

2. 计量置换保留理论（SDT-R ）。该理论适用于除体积排阻色谱以外的各类液相色谱的保留模型。认为在色谱保留过程中，当一个溶剂化的溶剂分子被溶剂化的固定相吸附时，在溶质和固定相的接触界面上必然要释放出一定计量的溶剂分子Z 。

3. 踏板理论。该理论将色谱过程比拟为蒸馏过程，把色谱柱看成是由一系列平衡单元-理论踏板所组成。在每一个踏板高度内，组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成。

4. 双膜理论。把流动相和固定相看成是两块相互紧密接触的平面薄膜，整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定相膜的传质阻力所构成，界面处无阻力，组分在界面接触处达到平衡分配。

5. 纵向扩散理论。由Amundson 等人通过大量实验提出，该理论认为在色谱过程中，组分在流动相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素，而有限的传质速率对区域谱带扩展没有影响。

2.高效液相色谱分析原理

高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。液相色谱柱的分离度用下列公式表示。

()()1114++-=k k a a n

R

式中：R-液相色谱柱分离度；

n-柱效率，用理论塔板数表示；

a-溶剂效率，是固定相对某两个混合物分离能力的表征；

k-容量因子，是在平衡状态下组分在固定相与流动相中质量之比。

从上面公式可以看出，要提高分离度，共有三条途径：

（1）增加n。在其他条件相同的情况下，增加n可以使色谱峰变狭。这点可以通过增加柱长实现，但是增加柱长分离时间也会增加，可以考虑使用高效的填充剂，使广峰变狭而提高灵敏度。

（2）增加a。改变移动相或者固定相的组成，能使后一组分相对于前一组分的保留时间增加来提高分离度。

（3）增加k。移动相极性减小，k增加，色谱峰的流出时间增加，同时峰形变化，分离度提高。但若k过大，峰形变平坦，也会影响分辨率和灵敏度。

3.高效液相色谱的基本装置

高效液相色谱由高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统组成。其工作过程如下：首先高压将贮液器中流动相溶剂经过进样器进入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

高压输液系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。流动相的最高压力为150~300kgf/cm2 。

进样器

进样器是供样品进入色谱柱的通道。通常有隔膜进样器和高压进样器两种。

色谱柱

色谱柱是色谱仪的心脏，由色谱柱管和管内固定相组成。色谱柱管大部分采用优质不锈钢制成，管内壁要求有很高的光洁度。高效液相色谱对固定相性能及装填技术有一定的要求。HPLC的重要进展之一，体现在对高效柱的研究上。目前，具有几千万理论塔板数的5um 或者10um多孔硅胶柱已经成为常规色谱分析的柱子。近年来，3um微粒硅胶也开始进入商品市场。这种柱虽然承受更大的柱压降，但由于保留值短，峰容积减少，柱效大有增加。对色谱柱的总的要求是柱效高、选择性好、分析速度快。目前的色谱柱多以反相柱为主，这种柱可以消除或减少碱性化合物与残余硅羟基的作用，因而在药物分析中得到广泛的应用。

检测器

检测器是HPLC的核心部件之一。其作用是将色谱柱流出物中样品的含量的变化转变为可供观测的信号，以便自动记录下来。这种电信号又称为色谱图。目前应用较多的有紫外检测器、荧光检测器、二极管阵列检测器等。

4.操作方法

1.进样前的准备工作

首先，使用的溶剂（流动相）要求具有较高的纯度。有机溶剂要使用色谱纯，使用前要用专门的滤膜过滤；用水要经过混合离子交换树脂处理和活性炭处理后，重蒸除去各种杂质并经

滤膜过滤后再使用。各种溶剂一般要求新鲜配制，使用前经过脱气处理。样品加入前，必须用流动相充分洗柱，待流出液经过检测器的基线校正，证明柱内残留杂质确已全部除尽，才能进样。

2.样品处理

在某些生物样品中，常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。他们的存在，将影响待测组分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱，使柱效降低，所以常需要对试样进行处理。样品的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、离心及超滤等。

3.洗脱

按事先计划好的溶剂程序进行。如果样品中各组分与固定相之间的亲和力差别较大，采用梯度洗脱方法，可获得较好的分离效果。流动相的速度，选择恒速或者变速或者每分段时间内要求流动相的流速。实际上，样品展开后所得的色谱图一次很难获得良好的分离效果，需要根据色谱图各组峰形状、位置进行综合分析，并按自己所需分析或制备的谱峰分离情况，调整流动相的极性梯度组合、流速及展层时间等。

4.色谱柱的清洗及保存

在正常情况下，色谱柱至少可以使用3~6个月，能完成数百次以上的分离。但是，若操作不当，将使色谱柱很容易损坏而不能使用。因此，为了保持柱效、柱容量及渗透性，必须对色谱柱进行仔细的保养。注意事项如下：

（1）色谱柱极其容易被微小的颗粒杂质堵塞，使操作压力迅速过高而无法使用。因此，必须将流动相仔细蒸馏或用0.45um孔径的过滤器过滤，以防止固体进入色谱柱中。

在水溶液流动相中，细菌容易生长，可能堵塞筛板，加入0.01%的叠氮化钠能防止细菌生长。

（2）色谱柱分离完毕后，应用溶剂彻底清洗色谱柱，或色谱柱存放过久也应定期清洗。（3）要防止色谱柱被振动或撞击；否则，柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。

（4）要防止流动相逆向流动；否则，将使固定相层位移，柱效下降。

（5）使用保护柱。连续注射含有未被洗脱的样品，会使柱效下降，保留值改变。为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱之间加上保护柱，其长度一般是3~5cm，填充与分析柱相似的表面多孔固定相，可以有效防止分析柱效下降。

6.生化制药方面的应用

1.用于生化药物的分析

HPLC在分离过程中不破坏样品的特点，使之特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的生化药品的分析，尤其在对具有生物活性物质的分析上，具有特殊的能力。此外，对于某些极性化合物如有机酸、有机碱等，使用液相色谱分析也较为方便。在生物化学和药学领域，HPLC广泛应用于氨基酸及其衍生物、有机酸、甾体化合物、生物碱、抗生素、糖类、卟啉、核酸及其降解产物、蛋白质、酶和多肽以及脂类等产物的分析。

2.用于生化药物的分离提纯

HPLC的使用，引发了生化医学方面的一场革命。这一方面表现在分子生物领域中对基因重组而得到的新基因的分离和提纯，单克隆抗体的纯化方面；另一方面在将基因工程产品

工业化生产时，使用HPLC能有地将产品从发酵液中提取出来，从而得到纯度足够高的、对人体无害的蛋白质药物和疫苗产品。目前，除聚合物外，大约80%的药物都能用HPLC 分离纯化，其中尤其以生化药品为多。对于一般手段较难分离的异构体药物及亲脂性很强的药物，采用硅胶柱即可达到分离的目的。与此同时，HPLC在对这类药物的质量控制上，也具有重要意义。

3.用于临床的快速分析

临床分析要求“短平快”，特别是抢救过程中，样品的检测要求在最短时间内完成以尽可能挽生命。对此，HPLC具有不可替代的优势。例如，在对氨基酸样品的分析上，20世纪50年代要经过离子交换等分离步骤，时间较长。现采用全自动氨基酸分析仪，但分析一个样品仍需要2~6h，这个时间对于临床来说仍然过长。HPLC进行这样的分析，所需时间大大缩短，如采用带梯带的HPLC-ODS柱分析氨基酸，不到1h即可完成一次分析。

7.高效液相色谱的展望

与其他制备方法相比，液相色谱是目前技术手段最成熟最广泛的一种。但是它的缺点也很明显，如需要消耗大量溶剂、产品过于稀释以及往往无法避免有毒溶剂的使用。另外色谱技术的最大弱点是定性能力差。因此将分离手段和分析手段联合成为一个整体，再配上专用的计算机，已经成为近代分析仪器发展的又一个中要方向。当前对各种检测手段及联机的接口，都还趋于摸索阶段或者只适用于某些领域，例如HPLC-AAS(原子吸收)、HPLC-LC(质谱)、HPLC-化学发光法、HPLC-电子捕获、HPLC-NMR(核磁共振)、HPLC-IR（红外）等。尽管如此，HPLC仍然是难以替代的分离方法。

超高效液相色谱作为一种新型液相色谱技术，延伸了液相色谱的应用范围。超高效液相色谱以超强的分离能力和速度、超高灵敏度、与HPLC简单方便的方法转换等特点为现代色谱分析开创了广阔的前景。

多维液相色谱技术在液相色谱技术的基础上发展而来。与一维分离模式相比，多维分离技术的最大特点是拥有更大的峰容量。蛋白质组学出现之后，多维高效液相色谱技术以其快速、高效、自动化程度高以及易于与质谱等其他技术联用等优势再次成为研究应用的热点，以shotgun技术为代表的多维液相色谱技术得到了空前发展。

基于液相色谱中溶质的计量置换保留理论（SDT-R）,蛋白质折叠液相色谱法中一系列实用技术也逐渐发展起来。

总的来说，高效液相色谱技术仍将会成为分析实验室的主力继续发展而不会被取代。