良好的液相实验室管理规范

反相色谱柱没有使用缓冲溶液，请使用以下 溶剂系列再生 100%甲醇---100%乙腈---75%乙腈---25%异丙 醇---100%异丙醇---100%二氯甲烷---100%正 己烷---100%二氯甲烷---100%异丙醇---100% 乙腈各三十分钟。注意用异丙醇时的流速


反相色谱柱使用缓冲盐溶液，请使用以下溶剂 系列再生： 水---75%乙腈---100%乙腈---氯仿-异丙醇（1： 1）---100%乙腈各30分钟。
色谱柱污染后如何清洗和再生？

一般来说，所有的清洗方法都是类似的形式。所有的 溶剂都是随溶剂的强度增加，经常最后一个容剂是非 常疏水的（如醋酸乙酯甚至烃），可以用来溶解非极 性物质如脂类和油类。我们必须保证一系列溶剂中每 个溶剂都能与下一个溶剂互溶。清洗过程结束时，必 须借助一个中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二 氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇的粘度 非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。冲洗 色谱柱时，冲洗液由色谱柱出液端直接流入废液，不 要经检测池，以免检测池被污染。
流动相的过滤

过滤器的清洗 过滤溶剂的时候要润洗，少量多次， 滤膜的选择，除了纯水用水系膜以外，其它的 溶剂过滤都要用有机系的膜 走梯度时用屈臣氏的水 配流动相进详细记录试剂的的来源，如试剂同 前一天一样，可写同前
仪器使用



开机，将流速逐步的调到所要流速，目的，不 适柱压突然升高。 需要停机时，逐步降低流速，若需要更换色谱 柱应待柱压基本为零时轻开前端PK管 注意每天清洗泵头（清洗泵头的目的）、进样 阀、进样针（进样针应无黑色污垢） 自动进样器的清洗液应每天更换。
良好的液相实验室管理规范
2011.07.05
概述





溶剂的准备 溶剂的使用 替换溶剂 系统管路和连接 色谱柱的选择 色谱柱的保护 色谱柱的使用温度 样品的准备
溶剂的准备

仪器 流动相的特性
仪器


过滤头（应泡在10%以上的有机溶剂中，以免 微生物生长。 在分析试验之前，要算总共需要多少流动相， 以便配制足够的流动相并装在合适的容器中。 流动相不足会造成系统抽干并充满空气。如果 该类情况发生，需要用新配制的流动相重新冲 洗系统并使基线平稳。
旧接头和漏接头的更换

高压或手拧接头都有一定的使用寿命，到期必 须更换。
色谱柱的保护

使用保护柱 在线过滤器 柱温
柱温

温度波动会引起色谱峰漂移并产生多种影响。 使用色谱柱时，保持柱温恒定非常重要。建议 使用柱温控制单元

色谱柱的使用温度在很大程度上还依赖于分析 条件和填料类型。典型的石墨化碳基质和聚合 物基质填料可以使用温度要远远高于硅胶基质 填料。温度升高会增加溶剂对键合相和硅胶基 质化学侵害的程度。例如在60℃ ，pH 2的缓 冲溶液中，键合氨基硅胶填料已经开始水解， 这一点从相关的谱图变化可以明显看出。公司 规定柱温不得超过40度，除标准明确规定外

10、 进样阀的通道十分微细，稍有脏物即易堵塞，所 以，样品预处理很重要。样品一定要溶解完全，同时 避免注射浓溶液，以免残留液在进样阀内析出结晶引 起堵塞，使系统压力异常上升。每次试验结束后，应
用水冲洗后，用甲醇保存。
色谱柱进样阀清洗

11、在使用缓冲盐做流动相实验前和结束后，
都要用含10%的甲醇水溶液冲洗管路，不能用

注意：拧紧接头的时候一定要仔细，过紧可能会破坏 螺纹、刃环等而引起漏液，最糟糕的是可能会使接头 断在螺母内。推荐用手拧接头，不仅简单方便，而且 可以避免此类问题。很多实验室有不同厂家生产的液 相色谱仪，因此应选择适合与所有仪器连接的通用柱 接头。
管路的堵塞

管路堵塞会导致系统压力升高、柱效降低或从旧接头漏液，此时 需要更换管路或清除堵塞物 清除堵塞物的步聚：① 将连接管取下，调换方向后直接与泵相 连，利用仪器反冲清除堵塞物，② 用适当溶剂以约0．5 mL／ min的流速冲洗管路以清除堵塞物，如堵塞物未知，可用50％ 甲 醇水溶液冲洗；如果堵塞物是不溶于流动相的密封圈碎片等时， 上述冲洗过程不能将其清除，可将流速增加到3～ 5 mL／min， 将堵塞物强行冲出(这是最后的选择)。如果堵塞物是溶剂中的杂 质，那么这样做比较危险。为安全起见，使用这种方法时应保证 废液管末端放置在封闭的烧杯或密封的废液瓶中。③ 如果管路 仍然堵塞，则必须更换新的连接管

7、 经常检查压力限制开关，检查流速。
压力

8、 HPLC输液泵的工作压力不要超过规定的 最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏 液。岛津设置30MPa
开机


9、 每次开机时，流速和柱压要逐渐加强，突 然增压会使柱压受到冲击引起絮乱，产生空隙， 使柱头塌陷。 同样关机时逐渐减小流速。
样品配制
空走泵

5、泵工作时要注意流动相不要被用完。否则 空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵 的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低 密封圈使用寿命。
双泵


6、 在使用双泵过程中，如果不是梯度洗脱， 尽量先混合。如果一个是有机溶剂，一个是含 盐溶液，在使用双泵的时候，有可能会析出晶 体。如果走梯度，如何检查流动相会不会析出 了？ 双泵的基线噪音较单泵大。
流动相的配制
配制有特殊气味的溶剂，去合成的通风橱操作。 如三乙胺、二乙胺等

替换流动相

互溶 正相反相：最好正相和反相分离系统，要将正相系统 转为反相系统或色谱柱的正相条件转变为反相条件， 需要用一种与常用正相溶剂和反相溶剂均互溶的中间 溶剂置换。反相系统中含有缓冲溶液时，要用50％ 的 甲醇水溶液替换100％ 的甲醇进行冲洗。例如：正相 时使用的溶剂为正己烷／乙酸乙酯，就要先用异丙醇 然后用甲醇，最后用50％ 的甲醇水溶液冲洗，然后转 为使用甲醇一缓冲溶液，使系统由正相转为反相。
密封环、缸体和单向阀。输液泵的滤器经常清
洗或更换。
腐蚀性的流动相

2、 流动相不应含任何腐蚀性的物质。例如氯 仿、丙酮、二氯甲烷等，这些溶剂将会使pk树 脂部件变脆；还有含有卤离子的流动相或能产 生卤离子的流动相，如果使用了，分析结束后， 应立即用去离子水清洗整个管路。因卤离子会 腐蚀不锈钢部件或管路。流动相含有缓冲盐， 不应停泵保留在泵内时间过长，由于蒸发甚至 由于溶液的静置就可能析出晶体。
色谱柱污染可能出现的情况

滞留在色谱柱中被吸附的样品积累到一定程度 足以使他们形成的固定相，有时候这些分析物 能与这些杂质作用形成一定的分离机理，这些 非目标产物的干扰能被检测器测到而且形成色 谱峰，气泡，基线扰动及基线漂移等现象，在 色谱图上出现“怪峰”，表现为负峰、宽峰、 馒头峰、双头峰及前吐舌后拖尾峰和保留时间 会波动。
增大流量的方法排除气体（不连接色谱柱），
或用纯乙醇等表面张力小的溶剂冲洗。
检测器

17、 防止检测池被污染。检测池被污染了可 能产生噪音，或基线漂移，可使用适当有机溶 剂（例：异丙醇等）清洗，如果污染严重，就 可以用1mol/L稀硝酸溶液，水和甲醇等进行清 洗。
注意事项

1、流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 2、避免流动相组成及极性的剧烈变化。 3、大多数反相色谱柱的PH稳定范围2-7.5， 尽量不超过该色谱柱的PH范围


在摸流动相条件时，尽量少配溶剂，可先用双 泵摸条件。 要注意观察水相和有机相能不能互溶。
流动相的特性



不要使用强酸或强碱溶液，因为pH过高或过 低会影响密封圈和柱塞杆。溶液的pH值要在 柱子适合的范围内 水含量较高的流动相中容易生长微生物。需一 天过滤一次。（90%以上的水相），水含量大 于95%以上，柱子碳链断裂，因此要考虑使用 合适类型色谱柱（AQ柱） 不要长时间将色谱柱或和HPLC系统充满水或 缓冲液，要经常用至少含20％ 的有机溶剂冲 洗系统。

பைடு நூலகம்


有些色谱柱既能做正相色谱，又能做反相色谱， 因此在使用和改变溶剂之前，一定要检查色谱 柱和流动相是否匹配。如氨基柱、氰基柱购买 此类色谱一定要看说明书，先看柱子溶剂是什 么，根据保存的溶剂确定柱子的流动相。 反相变正相 在尝试替换溶剂时，应确保系统和色谱柱中的 溶剂与新溶剂互溶。如果两种溶剂互溶性和物 理性质未知，可以把两种溶剂倒在烧杯中观察， 以避免直接进入HPLC系统可能出现不互溶问 题。
纯乙腈

3、 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向
阀粘住而导致泵不进液。针对岛津的液相。有
耐乙腈的进口阀除外。
挥发性的流动相

4、 不要使用挥发性很大的溶剂（如戊烷乙醚 等）。这类溶剂在运行过程中易挥发而使系统 产生气泡。流动相在使用前要脱气，以免产生 气泡。气泡的存在会造成色谱图上出现尖锐的 噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡 变大进入流路或色谱柱时会使流动相得流速变 慢或不稳定，使基线起伏。
螺纹引起渗漏。拧螺丝时使用的扳手应短些，
不宜太长。
pH值

15、 使用硅胶为基质的柱子，流动相的pH值
一般不应>8或<2，pH>8会使硅胶骨架溶解；
pH<2则键合相化学键易剥离。主要看柱子的 说明书。
气泡

16、 尽量避免气泡进入检测器，如果有气泡 连续不断的通过检测池，将会使基线的噪声增 大。如有较大气泡，则会在基线上出现许多线 状峰。如果检测池有停留的气泡，可采用突然
系统管路和连接

连接管的裁切 连接接头 管路的堵塞

理想的HPLC系统应死体积最小、不漏液。 不要用剪刀或剪钳切割HPLC连接管，因为它 们会导致管口变形，并形成锐角切口，这是液 体泄露和死体积增加的最主要原因。要用切线 钳。
连接接头

制作连接接头的材料主要有不锈钢和各种聚合物材料， 一般情况下不锈钢管用不锈钢连接接头，PEEK管用 PEEK接头。最好不要混合使用不同厂家的接头和刃 环，因为它们的尺寸可能不同，混用容易导致漏液、 损坏螺纹、破坏色谱柱进出口及检测器进液口螺母等 问题的发生。不同厂家的连接管伸入刃环的长度也可 能不同，连接管在螺母中没有良好的密封会导致漏液、 死体积增加等
样品的准备

HPLC分析中，样品的准备不仅仅是将固体溶 于液体中，还可能包括过滤、萃取、衍生以及 准确的称量和稀释等操作过程。样品中含有悬 浮固体杂质时需要过滤，也可以用上面介绍的 过滤器在线过滤或过滤到样品瓶中。注意：使 用膜过滤时要确保膜适合使用的所有溶剂。

溶解样品的溶剂与流动相应尽可能互溶，以避 免样品通过检测器时引起基线漂移和鬼峰出现。
纯水冲洗，因纯水会对柱子造成损坏。进样阀 要用适宜的溶剂进行清洗。
平衡色谱柱

13、 在注射样品前要使色谱系统平衡，通常 平衡10~20个柱体积的流动相。但如果在流动 相中加入少量添加剂则需要相当长的时间来平 衡HPLC色谱柱。需要柱子的充分平衡，然后
才能进行鉴定。
连接色谱

14、 不要把柱头拧得太紧，过紧易损坏接头
工作站使用


考虑工作站安装时间是否在建文件夹之前 当建好文夹以后不准有试验在建文夹时间之前， 要考虑合成的检样时间，所以最好建文件夹就 在起始原料购买的时间后。 修改电脑时间时应关闭工作站。 最好当天设计好试验，不要半路插图 对于失败的试验写明原因即可
高效液相的使用和维护

1. 流动相应用HPLC级的试剂，使用前过滤除 去其中的颗粒性杂质和其他物质（使0.45µm 或更细的膜过滤），防止固体微粒进入泵内。 因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞杆、
色谱柱柱效测定

流动相：甲醇-水（65:35） 溶剂：取苯与甲苯各5滴，用乙醇稀释至10ml。 流速：1ml/min 检测波长：254nm 以上均为普通C18和C8柱的使用与维护，对于 特殊的色谱柱必须经负责人领取，使用，按照 要求维护。