目的基因在宿主细胞中的表达
基因分泌表达
基因分泌表达
基因分泌表达是指利用基因工程技术,使目的基因在宿主细胞中表达,并将表达产物分泌到细胞外的一种表达方式。
这种技术常用于生产重组蛋白、酶、抗体等生物药物和工业酶制剂。
在基因分泌表达中,通常将目的基因与信号肽序列融合,使表达产物能够定位到细胞膜上,并通过信号肽的引导作用,将表达产物分泌到细胞外。
信号肽是一种短肽,能够引导蛋白质在细胞内的运输和定位。
在分泌表达中,信号肽的作用是将表达产物引导到细胞膜上,并促使其穿过细胞膜,进入细胞外环境。
基因分泌表达系统的构建需要考虑多个因素,包括宿主细胞的选择、表达载体的构建、信号肽的选择和优化、培养条件的优化等。
其中,宿主细胞的选择对于表达产物的产量和质量具有重要影响。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
不同的宿主细胞具有不同的优缺点,需要根据具体的表达需求和条件进行选择。
除了宿主细胞的选择外,表达载体的构建也是基因分泌表达的关键步骤之一。
表达载体需要包含启动子、信号肽序列、目的基因和终止子等元件,以确保目的基因能够在宿主细胞中正确表达并分泌到细胞外。
同时,还需要对信号肽进行优化,以提高表达产物的分泌效率和产量。
总之,基因分泌表达技术是一种重要的基因工程技术,能够生产大量的重组蛋白、酶、抗体等生物药物和工业酶制剂。
在实际应用中,需要根据具体的表达需求和条件,选择合适的宿主细胞和表达载体,并进行优化和调整,以获得最佳的表达效果。
质粒的作用
质粒的作用质粒(Plasmid)是细菌及其他真核细胞的一种重要遗传物质,是一个小而圆形的DNA分子,独立于细胞核的DNA存在。
质粒具有自主复制的能力,能够在细菌或真核细胞中独立地复制和传递,起到了多种重要的生物学作用。
质粒的主要作用有以下几个方面:1. 基因的存储和传递:质粒可以携带和传递大量的外源基因,包括抗生素耐药基因、亮蓝G、绿色荧光蛋白等重要的基因。
通过将外源基因插入质粒中,可以将其导入目标细胞,实现基因的转染。
这对于基因工程、基因治疗等研究具有十分重要的意义。
2. 分子克隆:分子生物学研究中,质粒是最常用的载体。
通过质粒的复制特性,可以大量地扩增目标腺病,以满足后续实验操作的需要。
同时,质粒载体还可以通过目的基因重组、限制性内切酶消化和连接等方法实现目标基因的插入、替换和删除,为后续功能研究和基因表达提供了便利。
3. 细胞遗传工程:质粒可以在细胞内进行重组,将目标基因插入到质粒中,然后将质粒导入到目标细胞中,从而改变目标细胞的遗传特性。
例如,通过将外源基因插入质粒并导入细菌中,实现细菌的遗传改造,使其具备特殊功能,例如合成某种特殊物质、分解有毒物质等。
此外,质粒还可用于构建RNA干扰(RNAi)系统,用于基因沉默和功能分析。
4. 目标基因表达:质粒可以用于在宿主细胞中实现目标基因的表达。
通过将目标基因与适宜的启动子和调控元件连接,并将其插入到质粒中,再将质粒导入到宿主细胞内,目标基因就可以在宿主细胞内转录和翻译。
这为大规模生产重组蛋白、对基因的功能进行研究提供了有力的手段。
总之,质粒作为一种重要的遗传物质,在生物学研究和应用中具有极为广泛的应用价值。
通过质粒的存储和传递,可以实现基因的克隆、表达和改造,为疾病研究、基因治疗和农业生产等领域提供了重要的工具和平台。
质粒研究对于解析基因功能、探索生命奥秘和推动生物科技的发展具有重要的意义。
基因工程名词解释
基因工程:按照预先设计好的蓝图,利用现代分子生物学技术,特别是酶学技术,对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造,将一种生物(供体)的基因转移到另外一种生物(受体)中去,从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程:广义:指以改变生物有机体性状为目标,采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作,以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义:基因工程。
限制性核酸内切酶:是可以识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶,简称限制酶回文结构:每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的,例如5'GGTACC3' 3'CCATGG5'.同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列(BamH I 和Bst I具有相同的识别序列G↓GATGC)同尾酶(isocaudiners):来源不同、识别序列不同,但产生相同粘性末端的酶。
两个同尾酶形成的黏性末端连接之后,一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。
BamH I 识别序列: G↓GATCCBgl II 识别序列: A↓GATCT黏性末端 (cohesive terminus/sticky ends):DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合,这样的DNA末端,称为黏性末端。
平末端(blunt ends): DNA片段的末端是平齐的。
星活性(star activity):指限制性内切酶在非标准条件下,对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应,导致出现非特异性的DNA片段的现象。
易产生星活性的内切酶用*标记。
如:EcoR I*底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。
连杆/衔接物(linker):化学合成的8~12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。
《目的基因的表达》PPT课件
➢ 包含体表达的优点
o 可以避免宿主的降解。 o 当以包含体表达时,目的基因产物的表达量也往往比较高, o 包含体容易纯化,往往仅通过简单的差速离心及洗涤等几步即可得到较
高纯度的目的蛋白。 o 当所表达的重组蛋白产物对宿主细胞具有毒性时,使重组目的产物以无
活性的包含体形式表达可能是蛋白表达的最佳方式。
一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径
为了在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质以满足商品生产 的广泛需求,仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的,所以,必须设 法提高克隆基因的表达效率。
许多因素诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、 mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和 寄主细胞的生理特征等,都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率,因 而从分析这些因素入手就能够寻找提高克隆基因表达效率的有效途径。
克隆基因末端的转录终止区的存在,可避免以下几种不利现象:
①若干非必须的转录本的合成,会使细胞消耗巨大的能量用于制造大 量非必须的蛋白质;
②在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构,从而降低了 转译的效率;
③偶然会出现启动子阻塞现象,即克隆基因启动子所开始的转录干扰 另一个必要的基因或调节基因的转译。
第八章 目的基因的表达
第一节 基因工程中的基因表达
一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响
不论基因工程的研究目的如何,最终均涉及到目的基因的表达问 题。
绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重 组体DNA分子和选择宿主细胞时,还须考虑外源基因表达的问题。
动物基因工程—目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞
二、基因导入方法
(1)显微注射法 利用显微注射仪,通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化
方法。 一般是微管吸取供体DNA溶液,在显微镜下准确地插入受体细胞核中,并将
DNA注入进去。此法常用于转基因动物的基因转移。
将外源基因用微玻璃管在显微镜下注射入受精卵细胞核中
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞(receptor cell)
作为基因工程的宿主细胞必须具备的条件: 便于重组DNA分子导入;能使重组DNA分子稳定 存在;便于便于重组体的筛选;遗传稳定性高,易于扩 大培养;安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生 物污染;利于外源基因蛋白产物高效表达。
目的基因导入受体细胞
入的外源基因进行遗传分析。
目的基因导入受体细胞
一、受体细胞(receptor cell)
原核生物受体细胞缺点
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统,即使真核生物基 因能得到表达,得到的多是无特异性空间结构的多肽链。
原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统,而许多真核生物蛋白质 的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。
二、基因导入方法
(4)基因枪法
又称微弹轰击法,是利用高速运行的金属颗粒(微弹,1um)轰击细胞时能进入细胞内的 现象,将包裹在金属颗粒(钨或金颗粒)表面的外源DNA分子随之带入细胞进行表达的基 因转化方法。
基本做法:先将外源DNA溶液与钨或金颗粒(直径0.5-um)共同保温,使DNA吸附于金 属颗粒表面,然后放电加速金属颗粒,使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞,外源 DNA随金属颗粒进入细胞内部。
具有趋化性的农杆菌移向这类植物受伤细胞,并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细 胞内部。根据这一性质,将待转移的目的基因组入Ti质粒载体,通过农杆菌介导进入 植物细胞,与染色体DNA整合,得以稳定维持或表达。
基因工程试题及答案解析
基因工程试题及答案解析一、选择题1. 基因工程中常用的限制酶是:A. 蛋白酶B. DNA聚合酶C. 核糖核酸酶D. 限制性核酸内切酶答案:D2. 基因工程中,用于将目的基因导入植物细胞的方法是:A. 电穿孔法B. 显微注射法C. 农杆菌转化法D. 脂质体介导法答案:C3. 下列哪项不是基因工程的基本步骤?A. 目的基因的获取B. 基因表达载体的构建C. 目的基因的扩增D. 目的基因的检测与鉴定答案:C二、填空题1. 基因工程中,常用的运载体有____、____和____。
答案:质粒、噬菌体、动植物病毒2. 基因工程中,常用的筛选标记基因有____、____和____。
答案:抗性基因、荧光蛋白基因、酶基因三、简答题1. 简述基因工程的应用领域。
答案:基因工程的应用领域包括农业、医学、工业、环境保护等。
在农业中,基因工程可以用于培育抗病、抗虫、抗旱等性状的作物;在医学领域,基因工程可以用于生产重组蛋白药物、基因治疗等;在工业上,基因工程可以用于生产酶、疫苗等;在环境保护方面,基因工程可以用于生物修复、污染物降解等。
2. 基因工程中,如何确保目的基因在宿主细胞中正确表达?答案:确保目的基因在宿主细胞中正确表达需要考虑以下几个方面:首先,目的基因需要有合适的启动子和终止子,以确保其在宿主细胞中得到正确转录和终止;其次,需要考虑目的基因的密码子偏好性,以确保其在宿主细胞中能被高效翻译;再次,需要考虑目的基因的稳定性,避免其在宿主细胞中被降解;最后,还需要考虑目的基因产物的后翻译修饰和定位。
四、论述题1. 论述基因工程在医学领域的应用及其可能带来的伦理问题。
答案:基因工程在医学领域的应用主要包括生产重组蛋白药物、基因治疗、疾病诊断和基因疫苗等。
重组蛋白药物可以用于治疗糖尿病、侏儒症等疾病;基因治疗可以用于治疗遗传性疾病;疾病诊断可以通过基因检测来实现;基因疫苗可以用于预防某些遗传性疾病。
然而,基因工程的应用也带来了伦理问题,如基因隐私权、基因歧视、基因治疗的安全性和有效性等。
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例基因工程是一门通过DNA分子的重组技术来改变或者改造生物体基因结构的科学技术。
它不仅可以用于基础研究,还可以应用于医学、农业和工业领域。
在基因工程中,病毒载体作为一种重要的工具,具有许多独特的优势和广泛的应用。
本文将介绍病毒载体在基因工程中的优势,并举几个应用案例进行讨论。
病毒载体在基因工程中的优势之一是其高度选择性,可以将外源基因有效地嵌入到宿主细胞的基因组中。
病毒载体的基因组通常很小,可以携带和传递较长的DNA序列。
此外,病毒载体经过长时间的进化,已经具备了高度有效的侵染宿主细胞的能力。
利用这些特性,科学家可以使用病毒载体来将目标基因传递到特定类型的细胞中,从而实现基因工程的目的。
其次,病毒载体在插入目标基因时具有高效性。
病毒载体可以很容易地与外源基因重组,使得目标基因在宿主细胞中高效表达。
病毒侵染细胞的过程中,目标基因会被病毒载体运输并插入宿主细胞的基因组中,从而可以在细胞内产生目标蛋白。
这种高效的表达方式使得病毒载体在基因工程中得到了广泛应用。
病毒载体还具有广泛的宿主范围,可以感染多种类型的细胞。
这一特性使得病毒载体在基因工程中的应用更加灵活多样。
不同的病毒载体适用于不同类型的细胞,科学家可以根据需求选择合适的病毒载体进行基因传递。
例如,腺病毒载体可以感染多种哺乳动物细胞,而慢病毒载体则可以感染较广泛范围的细胞类型。
下面,我们将介绍两个病毒载体在基因工程中的应用案例。
第一个应用案例是利用腺病毒载体进行基因治疗。
腺病毒载体具有高度感染人体细胞的能力,被广泛应用于基因治疗领域。
基因治疗是一种将正常基因导入病人体内,以纠正遗传性基因缺陷或者改善疾病症状的方法。
例如,在严重联免疫缺陷病患者中,科学家使用腺病毒载体将正常的免疫系统基因导入患者的造血干细胞中,以恢复其免疫功能。
第二个应用案例是利用慢病毒载体进行基因敲除。
慢病毒载体具有稳定的遗传物质传递能力,被广泛应用于基因组编辑和基因敲除中。
目的基因与载体连接的方法
目的基因与载体连接的方法基因工程技术是通过将外源基因导入到宿主细胞中,以改变宿主细胞的遗传特征。
在基因工程中,目的基因常常需要连接到载体上才能被导入到宿主细胞中。
下面将介绍几种常见的目的基因与载体连接的方法。
1. 限制性内切酶切割连接法限制性内切酶是一类能够识别特定的DNA序列并切割DNA链的酶。
利用限制性内切酶的特异性切割性质,可以在目的基因和载体的DNA链上选择合适的切割位点。
切割后的DNA链上会留下一段不互补的单链,这个单链被称为粘性末端。
将目的基因和载体分别经过限制性内切酶切割后,可以利用这种粘性末端相互结合,形成互补碱基配对,然后使用DNA连接酶将其连接起来。
2. PCR扩增连接法PCR (聚合酶链反应) 是一种常用的基因扩增技术。
利用PCR技术,可以通过引物扩增得到目的基因和载体的DNA片段。
设计引物时,在其序列的3'端加入适当的限制性内切酶切割位点,然后通过PCR扩增获得含有限制性内切酶切割位点的DNA片段。
然后,将PCR产物和载体经过限制性内切酶切割后,利用DNA 连接酶将它们连接起来。
3. 转座子连接法转座子是一种能够在基因组内移动的DNA序列。
转座子连接法的原理是利用转座酶催化转座子在目的基因和载体之间的移动。
首先,将转座子序列插入到载体的DNA链上,然后通过反转录酶合成一个带有转座子的RNA分子。
此RNA 分子与目的基因连接后,通过转座酶的作用,将整个RNA-目的基因-转座子复合物插入到目的细胞的基因组中。
4. DNA连接酶片段连接法DNA连接酶片段连接法利用DNA连接酶催化DNA片段之间的连接。
该方法使用DNA连接酶作为催化剂将目的基因和载体的DNA片段连接起来。
此方法需要目的基因和载体之间有一段互补的序列,以便DNA连接酶能够催化它们连接起来。
5. Ligation-Independent Cloning (LIC)连接法LIC连接法是一种无连接酶的连接方法。
该方法不需要限制性内切酶切割,也无需互补的粘性末端。
目的基因的表达
1) SD序列与rRNA的16S亚基3’ 端序列的互补程度,是影响翻译效率 的主要因素。
2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离 以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。
连接在SD序列后面的4个碱基成分的 改变也会对转译效率发生很大的影响。如 果这个区域是由4个A(T)碱基组成,其转 译作用最为有效;而当这个区域是由4个C 碱基或4个G碱基组成,其转译效率只及最 高转译效率的50%或25%。
有些强启动子会通读,干扰质粒的复制, 结果使质粒的拷贝数反而下降。
所以,在基因内部的适当位置上存在着 转录的终止区,就能够保证使质粒的拷贝 数(也就是基因的表达效率)控制在一个 正常的水平上。
一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响
原核细胞在翻译水平上的调控是不严 格的,只有RNA和核糖体的结合才是蛋白 质合成的关键。
(6)提高翻译水平常用的途径
➢ 包含体表达的缺点
当以包含体形式表达时,外源目的蛋 白表达产物需经过变性、复性等手段才能 得到有生物活性的蛋白。而提取的手段复 杂,并且回收率较低。
未形成包含体的水溶性活性物质在提 取过程中容易损失。
虽然目的基因产物以包含体形式表达有不少优 点,而且近年来随着蛋白复性技术研究的发展,许 多目的基因产物得以通过包含体变性、复性的方法 以一定的收率得到最终的产品。
限制蛋白质合成的第一步,是发生在核 糖体同mRNA分子结合的过程中的。
由于细胞中核糖体的数量与mRNA分 子相比是大大超量的,因此,提高克隆基 因表达效率的途径之一是增加相应的 mRNA分子的数量。
影响mRNA分子合成速率的因素有两种:
第一种是启动子的强度;
第十一章 目的基因的表达
第一节 目的基因表达的机制
一、 目的基因的起始转录及mRNA的延伸
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始 的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关 的调控序列,是构建一个表达系统首先要考虑的问题。
➢启动子的强度主要决定于启动子的结构组成。在原核 细胞中,启动子DNA序列中两个高度保守区域是必需的 (-10区和-35区)。但是启动子DNA序列中保守性较差 部分和两个保守区之间的核苷酸数量也影响启动子的效 率。
主要因素有以下几点: (1)SD序列与rRNA的16S亚基3'末端序列之间的互补 程度,是影响翻译效率的主要因素。 (2)起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列 的核苷酸组成对翻译能力的影响。 (3)起始密码子之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体 的结合的影响。 (4)基因末端转录终止区的影响。
第十一章 目的基因的表达
1. 目的基因表达的机制 2. 目的基因表达的制约因素 3. 目的基因表达系统
➢ 基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能 得到高效表达,即产生人们所需要的高产目的的基因 产物,如蛋白质、多肽类生物药物。
➢ 基因工程技术的核心是基因表达技术。到目前为止, 已构建了多种基因表达系统,包括原核生物基因表达 系统和真核生物基因表达系统,不同表达系统具有各 自特点。
有的载体的启动子后接有SD序列,而另一些载体的启动 子后没有接SD序列,那么则需要目的基因上游带进SD序列。
若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位 点较弱的原核基因,则必须从外部同时提供启动子和有效的 核糖体结位点。
•翻译起始密码子
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程,包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一,其原理主要包括以下几个方面:1. 基因克隆:通过酶切、连接等操作,将目的基因与载体连接起来,构建成重组质粒。
2. 转化:将重组质粒导入宿主细胞,使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选:通过选择性培养基和分子生物学方法,筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定:对筛选出的转化子进行鉴定,确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂:限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞:感受态细胞(如大肠杆菌DH5α)。
4. 基因组DNA:目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备:采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备:提取载体DNA,进行酶切处理。
3. 基因连接:将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化:将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养:将转化后的细胞涂布在选择性培养基上,培养过夜。
6. 筛选:挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定:对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果:根据PCR检测结果,筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定:对PCR检测阳性的菌落进行酶切,观察酶切图谱,确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定:对酶切鉴定阳性的菌落进行测序,与目的基因序列进行比对,验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验,掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒,并对其进行了鉴定。
分子生物学名词解释
三、名词解释基因工程:在体外应用人工方法进行基因重组,然后把重组的基因导入宿主细胞,进行复制、转录及翻译的过程。
PCR技术:针对插入重组体中的目的基因,设计一对引物,进行菌落PCR,如能扩增出条带,则为阳性克隆。
限制性核酸内切酶:识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
基因工程载体:供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或(和)复制的运载工具。
重组DNA技术:重组DNA技术简单概括为:“分、切、接、转、筛”1.分:分离目的基因2.切:对目的基因和载体适当切割3.接:目的基因与载体连接4.转:重组DNA转入受体菌5.筛:筛选出含有重组体的受菌体互补DNA:以mRNA为模板,利用反转录酶合成的与mRNA互补的DNA。
四、问答题1、简述基因工程的基本程序。
基本程序目的基因的获得(DNA片段)(分、切)↓DNA片段与载体基因的连接(体外重组)(接)↓连接产物(重组体)导入宿主细胞(转)↓重组体的扩增、筛选与鉴定(筛)↓目的基因在宿主细胞中的表达↓表达产物的分离纯化2、简述基因工程技术在医学上的应用。
(一)疾病基因的发现与克隆(二)生物制药(三)基因诊断(四)基因治疗(五)遗传病的预防三、名词解释1、受体:(receptor)细胞膜或细胞内的一些天然分子,能够识别和结合有生物活性的化学信号物质(配体,liganal),从而启动一系列信号转导,最后产生相应的生物学效应。
2、G蛋白:是一种鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白,一般是指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白。
3、MAPK:MAPK 通路是多种促增殖信号在细胞内信号转导的共同通路。
MAPK 的上游激酶MAPKK 或MEK 是一个DSPK,它能使MAPK 分子中的Thr 185 和Tyr 187 磷酸化而使该酶激活。
4、第二信使:细胞内的化学信号----第二信使5、PTK:酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, PTK )是一类能催化蛋白质酪氨酸残基(tyr或Y)磷酸化的蛋白激酶,共同特征是所极端具有典型的PTK结构域,该酶可催化自身或底物磷酸化。
重组蛋白的表达载体和表达方式
什么是重组蛋白?
重组蛋白(recombinant protein)是指应用重组 DNA 或重组 RNA 技术而获得的蛋白质。
重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因(gene of interest,GOI),连接到适合的表达载体,导入到特定的宿主细胞,利用宿主细胞的遗传系统,表达出有功能的蛋白质分子。
什么是表达载体?
表达载体(expression vector)是一种可以携带外源基因并在宿主细胞中进行表达的工具,它通常是一种质粒或病毒。
表达载体除了包含外源基因外,还需要包含一些必要的元件,如启动子、终止子、选择标记、筛选标记等。
重组蛋白的表达方式有哪些?
按重组蛋白的表达方式,表达载体大致可分为以下几种:
•单独表达:指目的基因单独编码一个蛋白质,在宿主细胞中以自由形式存在。
这种方式适用于大多数不需要翻译后修饰或结构域相互作用的蛋白质。
•融合表达:指目的基因与其他基因(如伴侣蛋白、纯化标签等)相连接,编码一个含有多个功能区域的融合蛋白,在宿主细胞中
以结合形式存在。
这种方式可以增加目的蛋白的溶解度、稳定性、纯化效率和活性检测等。
•分泌表达:指目的基因与一个信号肽基因相连接,编码一个含有信号肽的前体蛋白,在宿主细胞中经过分泌途径被运输到胞外或胞器内。
这种方式可以避免目的蛋白在胞质中形成包涵体或受到降解酶的作用,也可以实现一些翻译后修饰,如糖基化等。
基因工程的原理和技术
2、形成重组DNA分子
限制性核酸 ①用一定的_________切割 内切酶 质粒,使其出现一个切 粘性末端 口,露出____________ 。 同一种限制性核酸内切酶 ②用_____________切割 含目的基因的DNA ,使其产生_____ 相同 的粘性末端 ____________。
切口 处, ③将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ,形成了一个重组 再加入适量___________ DNA分子(重组质粒)
农杆菌转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,农杆 菌中细胞中含有Ti质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过 侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物染色体 中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农 杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后 通过植物组织培养技术,再生出转基因植株。
5、目的基因的表达
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 检测 方法—— DNA分子杂交(DNA探针) (分子水平) ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原抗体杂交 个体水平 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
程的叙述中,错误的是 ( A ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶
2.有关基因工程的叙述正确的是
(
D
)
A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可以作为运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
第一章
第二节
基因工程
基因工程的原理和技术
目的基因序列
目的基因序列目的基因序列是指在基因组中具有特定功能的基因序列。
基因是生物体遗传信息的基本单位,编码着生物体形态、功能和行为的特征。
目的基因序列的研究对于理解基因功能、疾病治疗和基因工程等方面具有重要意义。
目的基因序列的研究可以通过多种方法进行。
一种常用的方法是通过基因克隆技术来获取目的基因的序列。
基因克隆是指将目的基因从其所在的生物体中分离出来,并将其插入到载体中,然后将载体导入宿主细胞中,使其在宿主细胞中表达。
基因克隆技术可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接、DNA测序等步骤来获取目的基因的序列。
另一种常用的方法是通过基因组测序技术来获取目的基因的序列。
基因组测序是指对生物体的基因组进行全面的测序分析,可以获取到包括目的基因在内的所有基因的序列信息。
目前,基因组测序技术已经得到了极大的发展,可以高效、准确地获取大规模的基因序列数据。
通过对目的基因序列的深入研究,可以揭示其在生物体发育、生长、代谢和适应环境等方面的作用机制。
目的基因序列的研究可以帮助科学家们更好地理解基因功能。
通过对目的基因序列的分析,可以了解基因在生物体中的表达模式、调控机制以及与其他基因的相互作用关系。
这对于理解基因如何决定生物体的形态、功能和行为具有重要意义。
另外,目的基因序列的研究还可以揭示基因与疾病之间的关联,为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的依据。
目的基因序列的研究还可以为基因工程提供重要的支持。
基因工程是指利用基因组编辑技术对生物体的基因进行修改和调控的过程。
通过对目的基因序列的深入了解,可以设计和构建具有特定功能和特征的基因组,为生物体的改良和优化提供技术支持。
目前,基因工程已经在农业、医药和环境等领域得到了广泛的应用,为人类的生产生活带来了巨大的改变。
目的基因序列的研究对于理解基因功能、疾病治疗和基因工程等方面具有重要意义。
通过对目的基因序列的深入研究,可以揭示基因的作用机制,为疾病的预防和治疗提供依据,同时也为基因工程的发展提供技术支持。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤,掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术,并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中,使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理:1. DNA提取:利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切:利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列,并在这些序列上切割DNA分子,产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接:利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接,形成重组DNA分子。
4. 转化:将重组DNA分子导入宿主细胞,使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选:通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取:取一定量的大肠杆菌DH5α菌液,加入细胞裂解液,充分振荡,加入蛋白酶K,37℃水浴30min,加入酚/氯仿抽提,离心,取上清液,加入无水乙醇沉淀,离心,洗涤,溶解,得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切:将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切,酶切产物经电泳鉴定后,切胶回收酶切产物。
3. 连接:将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接,连接产物经电泳鉴定后,取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化:将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中,在冰浴中振荡,加入CaCl2,热冲击,涂布于含有抗生素的琼脂平板上,37℃培养过夜。
5. 筛选:挑选单菌落,进行PCR扩增,鉴定阳性克隆。
目的基因与载体的连接
目的基因与载体的连接
目的基因与载体的连接是指将目的基因(如外源DNA序列)与载体(如质粒、病毒等)进行连接,以便将目的基因导入到宿主细胞中进行表达。
常见的目的基因连接技术包括限制性内切酶切割与黏性末端连接,使用DNA连接酶连接,或利用PCR等方法扩增目的基因并连接到载体上。
连接后的目的基因与载体形成复合物,通过转染等方法将复合物导入宿主细胞中,使目的基因能够被宿主细胞转录和翻译,并产生相应的蛋白表达。
这样可以实现对目的基因的研究与应用,如基因治疗、基因工程等。
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T7噬菌体启动子表达载体系统:
T7噬菌体RNA 聚合酶活性很高,合成mRNA的的速率相当于大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍。
外源目的基因在原核细胞的表达形式
包涵体:是外源基因的高表达蛋白在原核细胞中积累,并致密地聚集在 一起形成的一种水不溶性蛋白质结构。易于分离纯化。具有正确的氨基 酸序列,但因其空间构象错误,故一般无生物学活性。 融合蛋白:将外源目的基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起,但不改 变两个基因的阅读框,以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。具有稳定 性好、表达效率高、较易于分离纯化的优点。
考虑外源目的基因的组成。主密码子和罕用密码 子。
常见的原核细胞表达载体系统 Plac 启动子表达载体系统:以大肠杆菌乳糖操纵
子调控机制为基础设计和构建的表达系统。
PL 和PR启动子表达载体系统:
PL 和PR启动子 是大肠杆菌λ 噬菌体中控制早期转录的启动子, PL 和PR 表达载体系统是该启动子构建的高效表达载体。
表达载体和受体菌
• GS115: Mut+ , His• KM71: Muts, His• SMD1168: Mut+, His-,蛋白酶缺陷型 • pPIC3.5K:5’ AOX1,MCS,TT,3’ AOX1,His4,
Kanr, ampr,
• pPIC9K:
5’ AOX1,MCS,TT,3’ AOX1,His4,ampr, Kanr,Sig, 5’ AOX1-MCS-TT的两端为BglⅡ和BamHⅠ
在原核细胞中高效表达目的基因 高效表达目的基因的基本策略 优化表达载体的构建 提高稀有密码子的表达频率 构建基因高表达受体菌 提高外源基因表达产物的稳定性 优化工程菌的发酵过程
• 优化表达载体的构建
在表达载体中组合进强启动子和强终止子 使SD序列(6-8bp)与核糖体16S rRNA中的碱基 完全互补配对 调整SD序列与起始密码子之间的距离及碱基的种 类 防止核糖体结合位点附近序列转录后的mRNA形 成二级结构
原核基因表达载体的构成
DNA复制及重组载体的选择系统 外源目的基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
• 这一系统与普通的克隆载体一样,由复制 起始点(ori)和选择标记基因来完成。
• 复制子是一段包含复制起始点(ori)和有 关序列在内的DNA片段。常见的复制子有 p15A、ColE1、pSC101等。
目的基因在宿主细胞中的表达
• 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录 成mRNA,经加工后在核糖体的协助下转译出相应 的基因产物—蛋白质,再在受体细胞环境中经修 饰而显示出相应的功能。 • 在原核生物系统中,基因表达是以操纵子形式进 行的。 • 在真核生物系统中,转录是在核内进行的,先生 成hnRNA,再加工修饰成mRNA。而mRNA只能在细胞 浆中的核糖体转译成多肽或蛋白质,再经过加工、 糖化、形成高级结构。
分泌信号序列是前体蛋白N端一段长17-30个氨基酸残基 的分泌信号肽编码区,主要功能是引导分泌蛋白从细胞内 转移到细胞外,并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。
酵母菌基因表达载体的类型 自主复制型质粒载体(YRP):200个拷贝 整合型质粒载体(YIP):不含酵母DNA复制起始 区,含有整合介导区,可通过DNA的同源重组将外 源基因整合到酵母染色体上。 着丝粒型质粒载体(YCP):在YRP的基础上,增 加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件。 酵母人工染色体(YAC):在酵母细胞中以线性双 链DNA的形式存在,每个细胞中只有单拷贝。 表达外源基因的酵母宿主菌主要有: 酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母
真核细胞表达载体的功能元件 启动子元件 增强子元件 加poly(A)信号 剪接信号 与翻译相关的元件 用于复制和选择的元件
酵母菌基因表达载体的组成元件
DNA复制起始序列:由两类复制起始序列共同组成 DNA复制起始区。 选择标记:包括营养缺陷型选择标记和显性选择 标记。 有丝分裂稳定区:决定载体在宿主细胞分裂时平 均分配到子细胞中去,来源于酵母染色体着丝粒 片段 表达盒:由启动子、分泌信号序列和终止子等组 成。
作为诱变剂的寡核苷酸序列,同待诱变的目的基因的互补序列之间, 应形成一种稳定的唯一的双链结构;
寡核苷酸引物中的错配碱基必须得到保护,避免遭受DNA聚合酶的 外切核酸酶活性的删除作用。
• 主要步骤:
将待突变基因克隆到突变载体上 制备含突变基因的单链模板 引物与模板退火:形成一小段错配碱基的异源双链的DNA 合成突变链: DNA聚合酶和连接酶作用,产生闭环的异源双链
SD序列与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体 结合,对mRNA的翻译起着决定性的作用。
翻译起始密码子通常为AUG(ATG)。 SD序列与起 始密码子之间的距离一般为6-8bp,多数情况为7 个碱基。 SD序列后面的碱基为AAAA或UUUU时,翻 译的起始效率最高。
一般选择UAA作为翻译的终止密码。实际中,通常 将几个终止密码子串联。
• 寡核苷酸引物诱变法
原理:用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段(诱变剂) 作引物,启动单链DNA分子进行复制,使这段寡核苷酸引物成为新 合成DNA子链的一个组成部分,由此所产生的新链便具有已发生突 变的碱基序列。 技术要点:
用作定点诱变剂的寡核苷酸片段长度范围为8-18个核苷酸;
所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基之外,其余的则 与目的基因编码链的特定区段完全互补;
巴斯德毕赤酵母(甲醇酵母)表达系统
• • • • • 甲醇酵母的生物学特性 表达载体和受体菌 甲醇酵母的转化与目的基因的整合 甲醇酵母表达系统的优点 影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
甲醇酵母的生物学特性
• 能利用甲醇为其惟一碳源。 • 乙醇氧化酶:强启动子,可调控异源蛋白的表达。 甲醇酵母中编码乙醇氧化酶的基因有两种:AOX1和AOX2, 绝大多数乙醇氧化酶的活力由AOX1提供。当以甲醇为其惟一 碳源时,AOX1基因的表达被甲醇严格调控,并被诱导到相当 高的水平,可占整个细胞可溶蛋白的30%以上。 • AOX1基因的调控是一个两步过程:抑制机制(以葡萄糖或甘 油为碳源)加上诱导机制(以甲醇为碳源) • Muts 和Mut+
外源目的基因在原核细胞中的表达
• 原核细胞表达的特点 (1)只有一种RNA酶; (2)表达以操纵子为单位的; (3)转录与翻译是耦联的,也是连续进行的; (4)缺乏真核细胞的转录后加工系统; (5)原核生物基因的控制主要在转录水平,比对 基因产物的直接控制要慢; (6)大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上含有SD序 列。
• pAO815:5’ AOX1,MCS,TT,3’ AOX1,His4,ampr,
抑制物基因的产物是一种控制启动子功能的蛋白质,对启动子的 转录功能产生抑制作用。可恢复。
终止子(terminator)是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。终 止子可避免作多余的转录,提高目的基因的转录量;同时防止产 生不必要的转录产物,提高mRNA的稳定性,避免质粒上其他基因 的异常表达。 可分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。
基因定点诱变技术 所谓基因定点诱变技术,就是在体外特异性地取代、 插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术。 研究基因的结构与功能的关系 改变重组载体的碱基序列以提高基因表达水平 使特异的氨基酸发生改变,获得突变体蛋白质
定点诱变方法主要有: 盒式取代突变 寡核苷酸引物诱变 PCR定点诱变。
的DNA
转化和初步筛选 对突变体基因进行序列分析
• 寡核苷酸引物介导的定点突变 优点:保真度比PCR突变法高,经改进 后该方法突变成功率大大提高; 缺点:操作过程环节复杂、周期长, 而且在克隆待突变基因时会受到限制 性酶切位点的限制。
• PCR定点诱变 原理:PCR扩增引物与模板DNA之间错配的 单碱基,在经过扩增之后会掺入到模板序 列中去,最终产生出突变体的双链DNA分子。 获得目的突变体的效率可达100%。
• 盒式取代诱变 利用一段人工 合成的具有突 变序列的寡核 苷酸片段(寡 核苷酸盒), 取代野生型基 因中的相应序列。
• 盒式突变法: 优点:简单易行,突变效率高,可以在一 对限制酶切位点内一次突变多个位点。 缺点:合成多条引物的成本较高,另外, 在一般情况下,在靶DNA片断的两侧往往难 以满足存在一对限制性酶切位点的要求, 限制了该方法的应用,然而一旦具备了这 样的条件,该方法则为首先。
寡聚型外源蛋白:在构建外源蛋白表达载体时,将多个外源目的蛋白串 联在一起,克隆在质粒载体上,以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型 外源蛋白。
整合型外源蛋白:将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上, 使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传,以这种方式表达的外源蛋 白称为整合型外源蛋白。 分泌型外源蛋白:外源基因的表达产物,通过运输或分泌的方式穿过细 胞的外膜进入培养基中,即为分泌型外源蛋白。
• 提高外源基因表达产物的稳定性
采用分泌型表达系统 使目的基因表达为融合蛋白的一部分 构建包涵体表达系统 选用某些蛋白水解酶缺陷型菌株作为受体 菌 对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰 或改造
• 发酵过程的优化 选择合适的发酵系统或生物反应系统 合理设计培养基的营养成分与细胞生长的 关系 调节发酵系统中合适的溶氧、pH值和温度 等条件,控制细胞的生长速度和代谢活动。 优化外源基因表达条件,提高菌体浓度和 表达水平,从而提高外源基因表达产物的 总量。
松弛复制型 严谨复制型
• 一般选择抗生素抗性基因作为选择标记基 因,常见的有抗Amp、Tet、Spec、Str等抗 性基因。
• 外源目的基因的转录系统包括启动子、抑制物基因和转 录终止子。
启动子(promotor)是一段能被RNA聚合酶特异性识别和结合并 指导目的基因转录的DNA序列,是基因表达调控的重要元件。与 mRNA的合,对要表达的外源基因来说,最佳距离有待确定。 可分为组成型启动子、组织或器官特异型启动子、诱导型启动子。