第六章目的基因导入受体细胞及重组子的筛选案例

■阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称 为阳性克隆子或期望重组子。 ■筛选（选择）：经过各种方法将外源 DNA分子导入受体细胞 后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
■脂质体介导法 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜 状结构，可以将 DNA包在其中，并通过脂质体与原生质体的融 合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。 ■显微注射法 显微注射法是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源 DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主 要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞 的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。 ■花粉管通道法 此法是将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或 传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合 子及早期的胚胎细胞。
■电穿孔法 同原核细胞的电穿孔法。 ■激光微束穿孔转化法 利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性 微孔，处于细胞周围的DNA分子随之进入细胞。 ■超声波介导转化 超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外 源DNA进入细胞。
■基因枪法 利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在 金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞。
■缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的 RNA 转录后加工、修饰系 统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细 胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得 了表达，也不具有正常的生物学活性。
■常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。
大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。 细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠 杆菌工程菌生产的。 枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。能将基因
辅助菌（含有结合型辅助质粒）
辅助质粒转移
供体菌（含有目的质粒）
含有目的基因的非结合型重组质粒迁移
受体菌
■转化率的计算及其影响因素 转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。 转化率 = 转化子数 / DNA 分子数 （10-5表示 105个DNA 分子获 得一个转化子） 或 转化子数 / DNA质量（106/µg表示1 µg DNA分子得106个转 化子）
菌体悬浮于含 CaCl2 的 预 冷 缓 冲液中，冰水浴 15min， 4 ℃离 心集菌，弃上清， 沉淀物重悬于 CaCl2 的 预 冷 缓 冲液中，4 ℃下 放置12-14 h
37 ℃震荡培养 30-60 min
铺板培养
筛选转化子
图6.1 感受态细胞的制备及转化
图6.2 电穿孔仪及电击杯
图6.2 λ噬菌体的体外包装
表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力， 易于保存和培养。 蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达 的宿主。
（2）真菌细胞
真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制 以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表 达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。 （3）植物细胞 优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的 植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳 定遗传的转基因植物。
影响转化率的因素 a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞 的亲和性。 b：菌株类型
c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂交 接合法最低。
（2）重组λ嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌
■转染（transfection）及转导（transduction）
转染：将重组λ噬菌体DNA 分子直接导入受体细胞中的过程称 为转染。 转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源 DNA分子 转移到受体细胞内的过程。
活化菌种，扩大培养，使其 处 于 对 数 生 长 后 期 （OD600=0.4）
3-4 ml菌液冰水浴中10 分钟，4 ℃离心集菌
转 入 37 ℃ 水 浴 上5 min， 加入 1 ml不含选择性 药 物 的 LB 培 养 基
转入42 ℃水浴 上 2 min ， 使 感受态细胞吸 收重组DNA。
0.2 ml 新制备好 的感受细胞中加 入缓冲液溶解的 重 组 DNA ， 置 于冰水浴中1 h 以上，期间轻摇 几次
2.重组DNA分子转入真核细胞
由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂， 适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。 但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方 法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。
（1）重组DNA分子导入植物细胞 ■农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒 -Ti 质粒的T-DNA 能转移至细胞内部。因此，将外源基因与 Ti 质粒 重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。
第六章 目的基因导入受体细胞及重组子 的筛选
第一节 受体细胞
1.受体细胞的概念
受 体 细 胞 （ receptor cell ） ： 又 称 宿 主 细 胞 或 寄 主 细 胞 （host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定 维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的 细胞。 随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细 胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工 程的受体细胞。
2.受体细胞选择所应遵循的原则
便于重组DNA分子导入。 能使重组 DNA 分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶 缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。） 便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配的 受体细胞基因型）
遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。
安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于 外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效 分泌表达。
采用λ噬菌体 DNA 直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对 重组的λ噬菌体 DNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染 大肠杆菌。 ■体外包装
体外包装：在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的 一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体 DNA分子包装成 成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。 原理：根据λ噬菌体DNA分子体内包装的途径，分别获得缺失D 包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失 E包装蛋白的λ噬菌体突变 株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的 包装λ噬菌体 DNA。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从 中提取缺失 D蛋白的包装物（含E蛋白）和缺失 E蛋白的包装物 （含D蛋白），两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。
3.重组DNA分子导入哺乳动物细胞
哺乳动物的细胞很难捕获外源 DNA ，这明显影响了哺乳动物 基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外 源DNA导入哺乳动物细胞的方法。 ■病毒颗粒转导法
■磷酸钙转染法
哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物， 使DNA转入细胞。
■DEAE-葡聚糖转染法
受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。
具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
3.各种类型受体细胞的优缺点
（1）原核细胞
■优点
大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源 DNA的进入。 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA 与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 基因组简单，பைடு நூலகம்含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外 源基因进行遗传分析。 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料， 并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。
Fig. 4-16 TDNA can integrated into the genome of plant cell
■多聚物介导法
一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二 价阳离子（ Ca2+ 、 Mg2+ 、 Mn2+等）于 DNA 混合，能在原生质体 表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入 细胞内。
缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。 方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。 （b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等。 （4）动物细胞
■优点：
动物细胞具有 RNA 的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译 后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。 易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。 可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。 ■缺点： 不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细 胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。
二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现短时间的有效表达。
■聚阳离子-DMSO转染法 此方法采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，增加细 胞表面对DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暂处理细胞， 增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。 ■显微注射转基因技术 ■电穿孔DNA转移技术 ■脂质体介导法
第二节 重组DNA分子导入受体细胞
1.重组DNA分子导入原核细胞
（1）重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 ■转化（transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结 合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之 为转化。 ■转化的方法
制备感受态细胞法
感受态细胞：处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态的细 胞。
第三节 重组子的筛选
在重组DNA 分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受 体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能 进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含 有我们期待的 DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或 一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所 致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中 筛选出来。 ■转化子：导入外源DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为转 化子。 ■重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。