聚合酶链反应一单链构象多态性分析
检查rao虫的主要方法
检查rao虫的主要方法检查rao虫的主要方法包括外观观察、实验室鉴定、分子生物学检测等。
下文将对这些方法进行详细介绍。
1. 外观观察:外观观察是最直观的方法之一,通常通过肉眼或显微镜观察rao虫的形态特征,如体长、体色、体壳形状等。
通过观察,可以初步判断是否存在rao虫的存在,并对不同性别、发育阶段进行分类鉴定。
2. 实验室鉴定:实验室鉴定是通过对采集到的样本进行处理、培养和观察来确认rao虫的方法。
常用的实验室鉴定方法有:- 石蜡切片法:将样本固定在石蜡切片上,经过染色,然后使用显微镜观察样本的细胞结构和特征。
- 螺旋藻胃分析法:将采集的水样中的rao虫进行分离,然后将其注入到螺旋藻胃中,通过观察螺旋藻胃内的消化内容物,判断是否存在rao虫。
- 多态理论分析法:通过对rao虫的形态特征、生长特性、生活史等进行综合分析,判断其种类和性别。
3. 分子生物学检测:分子生物学检测是一种利用DNA或RNA序列进行rao虫检测的方法。
常用的分子生物学检测方法有:- PCR(聚合酶链反应):通过反应体系中的DNA引物与基因组DNA进行扩增,利用特定的引物和酶进行rao虫的检测和鉴定。
- 单链构象多态性(SSCP)分析:通过PCR扩增特定DNA段,利用DNA的单链构象多态性来鉴定不同的rao虫种类。
- DNA测序:通过将rao虫的DNA提取、纯化,然后进行测序,再进行序列比对和分析,来确定rao虫的种类和亲缘关系。
综上所述,检查rao虫的主要方法包括外观观察、实验室鉴定和分子生物学检测。
这些方法可以相互配合,为rao虫的解析和鉴定提供全面的信息,有助于开展相关的研究和防控工作。
聚合酶链反应—单链构象多态性分析在精子发生相关基因检测中的应用
聚合酶链反应—单链构象多态性分析在精子发生相关基因检
测中的应用
周作民
【期刊名称】《生殖医学杂志》
【年(卷),期】1998(7)4
【摘要】用聚合酶链反应方法检测了染色体核型正常的200例无精子症患者基因组DNA中的DYS1基因,发现8例有DYS1的缺失。
选择60例DYS1阳性患者进行聚合酶链反应-单链构象多态性分析,发现了1例有多态性的改变,提示DYS1的点突变亦与无精子闰盯关,认为,对于DYS1阳性的无精子症患者有必要事酶链反应-单锭DNA多态性分析。
【总页数】1页(P212)
【作者】周作民
【作者单位】南京医科大学组织胚胎学教研室;南京医科大学组织胚胎学教研室【正文语种】中文
【中图分类】R698.2
【相关文献】
1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症研究中的应用 [J], 郦明芳;范乐明;管晓翔;李崇勇;陈琪
2.聚合酶链反应-单链构象多态性银染后胶回收在基因改变检测中的应用 [J], 王琦光;郭志刚;赖文岩;朱鲜阳
3.原位聚合酶链反应技术及其在消化道肿瘤相关病毒基因检测中的应用 [J], 曾维正;蒋明德;褚桂珍;陈渝;邓桂英
4.应用荧光单链构象多态性聚合酶链反应分析16SrRNA基因快速鉴别血培养物中的细菌类别 [J], 徐兵
5.无精子和少精子症患者Y染色体精子发生相关基因检测分析 [J], 李启运;石之磷;王沙燕;王长花;胡玉华
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分子生物学-聚合酶链反应(PCR)
引物3’端错配对扩增效率的影响
5’
2014年12月8日星期一
21
PCR反应的缓冲体系:PCR的缓冲液一般 制成10×,含有:500mmol/LKCl; 100mmol/LTris-HCl(pH8.3);15mmol/L MgCl2;0.1%明胶。 使用时稀释10倍。其中Tris-HCl可维持 反应体系的pH, KCl有利于引物的复性, 但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性, 明胶可保护酶不变性失活,Taq酶需要Mg2+, 它会影响反应的特异性和扩增DNA的产率, 因此要将Mg 2+浓度调至最佳。
底物:dNTP常用的浓度为 20~200μmol/L,而且4种dNTP的终浓 度相等。 dNTP浓度过高虽可加快反应 速度,但会增加碱基的错误掺入率,适 当的低浓度会提高反应的精确度。另外, dNTP是磷酸根的来源,会与Mg2+结合, 也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之 间的关系。
2014年12月8日星期一 25
2014年12月8日星期一 27
为防止PCR过程中出现假阳性,应设 臵以下几个对照: (1)阳性对照:阳性DNA模板参与的 PCR反应; (2)阴性对照:阴性DNA模板参与 的PCR反应; (3)试剂对照:不含任何DNA模板, 但具有所有反应试剂的PCR反应。
2014年12月8日星期一 28
PCR循环次数与产物的积累:
–常用温度为72℃ –过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间:根据待扩增片段长度而定
–1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min(足够) –3~4kb的靶序列需3~4min –扩增10Kb需延伸至15min
• 延伸进间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些
琼脂糖凝胶电泳操作步骤
实验原理、材料、方法、结果、讨论琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶的制备:溶化,冷却,EB凝胶板的制备:加梳子,倒胶样品的制备:样品+1/5体积溴酚蓝加样:加样端为负极(黑)电泳:5V/cm观察:紫外灯下观察,照相PCR-SSCP聚合酶链反应单链构象多态性PCR实验原理:在微量离心管中,加入适量的缓冲液,模板DNA,dNTPs ,Taq DNA 聚合酶,一对引物,以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环,经过25~35次循环,最终使特异区段的DNA扩增数百万倍,满足分子生物学下游操作。
介绍:PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
PCR-SSCP分析的基本程序:1、通过PCR扩增特定靶序列,2、将扩增产物变性为单链,3、进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
PCR反应体系:(单位:微升)Buffer液: 2.5引物1: 1引物2: 1dNTP: 2模板DNA: 1双蒸水: 16.5Taq DNA聚合酶: 1非变性聚丙烯酰胺凝胶:1、30%聚丙烯酰胺(交联度49:1) 4ml,2、50×TAE缓冲液 0.2ml,3、1%TEMED 1ml5、蒸馏水 4.7ml,4、10%过硫酸铵(AP) 0.1ml银染步骤:1、电泳结束,小心取出凝胶,置10%乙醇液中固定5分钟。
(防止再扩散)2、置凝胶于1%硝酸氧化3分钟。
(预处理)3、用双蒸水荡洗凝胶1分钟,换液两次。
4、置凝胶于0.012mol/L硝酸银液中20分钟。
使银离子与DNA结合。
5、弃去硝酸银,用双蒸水荡洗凝胶1分钟,换液两次。
6、用0.019%甲醛液,含0.28mol/L无水碳酸钠使胶还原,银离子变成银颗粒而显色。
直至所需的显色深度。
7、置凝胶于10%冰乙酸停止还原反应。
PCR-单链构型多态性分析
0.1%AgNO3 染色 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠 碳酸钠-0.03%甲醛显色 碳酸钠 甲醛显色 1%乙酸终止 乙酸终止 dH2O漂洗 漂洗
影响PCR-SSCP的因素 的因源自 影响1.DNA片段大小 片段大小 2.复制错误发生 复制错误发生 3.电泳条件 :(1)丙烯酰胺的浓度 电泳条件 ( ) (2)交联剂的浓度 ) (3)电泳的物理环境 ) (4)甘油浓度 )
PCR-SSCP与RFLP比较 与 比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便, 操作简便,无需特殊的仪器设备及试剂 改变容易影响SSCP 电泳条件的 改变容易影响
PCR-SSCP 的应用
1.基因点突变的监测 基因点突变的监测 2.多态性检测 多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查 筛查
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 一定条件下可以与银离子结合, 基,一定条件下可以与银离子结合, 在甲醛等还原剂的作用下, 在甲醛等还原剂的作用下,形成黑 或褐色的银沉淀条带。 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶 10%乙酸、30%乙醇固定 乙酸、 乙醇固定10min 乙酸 乙醇固定
dH2O漂洗两次
PCRPCR-单链构型多态性分析
Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP
什么是PCR-SSCP?
PCR-SSCP是在完成靶 是在完成靶DNA的PCR扩增 是在完成靶 的 扩增 单链DNA多态性分析的一种新 多态性分析的一种新 之后进行单链 多态性分析 之后进行单链 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 方法。将单链的扩增DNA或组织基因组 DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱 基的改变。 基的改变。
应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测散发性乳腺癌EMSY基因的突变
Z A G H iin L u - i JA GJa — u .D p r etfG sone ia Ga dS re , h it H N a t , U Y n e, I N inc n eat n at it t l ln ug r teFr a f h m o r sn y s A l t o i lfG a g i dclU i r t, a nn 3 0 , hn f i e H s t u n x i n e i N n i 5 0 2 C ia i f a d pa o Me a v sy g 1
医刊 2 1 年 月 3 01 s鲞箜
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论合 酶链 反 应 一单链 构 象 多态 性 分 析 检 测 散 发 性 乳 腺 癌 E Y基 因 的 突 变 MS
刘竞 张海添 陆云飞 蒋建春
【 s at Obet e T e t esg fm ttniom tno E Y gn nso dc Abt c】 r jcv ogth m saeo uaa n rao f MS eei pr i i e i f i a
b e s a cn ma tsu s h n i v siae t e a s cai n o S g n t t n a d s o a i r a tc r i ra tc r i o is e ,te n e t t h s o ito fEM Y e e mu a i n p r d c b e s a c— g o n Ra d s a e M e ho s Tis e fo 7 poa i r a tc r i o a p t ns a d 1 pt m r a tt mo o ie s . t d s u r m 2 s r d c b e s a cn m a i t n o i e 8 mu b e s u r
PCR-单链构型多态性分析
银染原理
根据核酸分子带有多个氨基和亚氨 基,一定条件下可以与银离子结合, 在甲醛等还原剂的作用下,形成黑 或褐色的银沉淀条带。
银染过程
凝胶
10%乙酸、30%乙醇固定10min
dH2O漂洗两次
0.1%AgNO3 染色10min
dH2O漂洗两次
2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗
PCR-SSห้องสมุดไป่ตู้P 的应用
1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查
2. 将提取的DNA在20l变性溶液(95% 甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、 0.05%二甲苯青),95℃ 10分钟,冰浴 3分钟。
3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶 板孔中,在含1xTBE的电泳液中,电泳。
4. 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄 膜上,烘干后以放射自显影拍摄记录。 或银染色
SSCP原理
在SSCP凝胶中电泳时,单链DNA的泳 动速率主要取决于二级空间结构,因此 若DNA片段中碱基发生突变,将会引起 单链DNA二级空间结构的改变,使 SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带(即 SSCP 阳性)。
PCR-SSCP 操作步骤
1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标 DNA片段的提取。
影响PCR-SSCP的因素
1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :(1)丙烯酰胺的浓度
(2)交联剂的浓度 (3)电泳的物理环境 (4)甘油浓度
PCR-SSCP与RFLP比较
无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便,无需特殊的仪器设备及试剂 电泳条件的 改变容易影响SSCP
PCR-单链构型多态性分析
聚合酶链反应-单链构象多态性分析Kallmann综合征的基因突变
2 结 果
2例 同胞 兄弟应 用 P R不能扩增 C
A 一 基 ~0 变 . 响 G R 神 经 细胞 迁 移 及 嗅 束 、 4 , Y;5 部分 病 人可 能有 阳性 家族 到 K L 1 因外 显 子 5 1 ,而 能 扩 影 nH 6X () A - 嗅 球 的 形 成 .进 而 引起 性 腺 功 能 低 下 史 ,但散发 性者并无 阳性 家族史 ;6 增 到 另 外 8个 外 显 子 。所 有 的 K L 1 ()
1 对 象 和 方 法
Kl n al n首先报 道 了 3个家 族 中 ma
1 ,含各样本基 因组 DN 0 n , 0l A 10 g上 的 1 2例类无 睾症 , 中 9例伴有 嗅觉 其
下 游 引 物 各 4 p o/ ,N P 25 mo 缺失 , 0 m lL d T .n l / 并认 为是遗传性 疾病 …。 病几 本 女 主 L T q酶 1 ( 国 Po ea公 司 生 乎 限 于 男 性 , 性 罕 见 , 要 特 征 是 : ,a U 美 rm g
性 征 表 现 不 明显 。部 分 患 者 合 并 嗅 觉 性腺 激素和睾 酮 明显 低下 。除 少数病 Bg y 端 循 环 序 列 试 剂 盒 (E 公 司 iD e末 P
障碍 。 部分 合并某些 先天性肢 体畸形 , 人 有 生 长 激 素 缺 乏 外 ,无 其 他 轴 系 激 生 产 )及 A I R M3 0自动 循 环 序 列 BP S 7
C 引 反应 ( C ) P R 和单链构 象多态 性 (S P) 个 外 显 子 用 P R 扩 增 , 物 设 计 按 照 SC
临床医学检验:分子生物学检验技术试题及答案预测题
临床医学检验:分子生物学检验技术试题及答案预测题1、单选用下列方法进行重组体的筛选,哪项说明外源基因进行了表达() A.Southern印迹杂交B.Northern印迹杂交C.原位菌落杂交D.Western(江南博哥)印迹E.基因芯片技术正确答案:D2、名词解释退火正确答案:指将温度降至引物的TM值左右或以下,引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。
3、填空题核酸分子杂交可分为:________________、________________、_____________________。
正确答案:DNA与DNA杂交;DNA与RNA杂交;RNA与RNA杂交4、名词解释细胞癌基因正确答案:存在于正常的细胞基因组中,与病毒癌基因有同源序列,具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。
在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因,当其受到某些条件激活时,结构和表达发生异常,能使细胞发生恶性转化。
5、判断题原位杂交常用来直接检测细胞或组织中的DNA或RNA()正确答案:错6、单选基因异常表达检测的技术是()A.荧光定量PCR技术B.western印迹技术C.Southern电泳技术D.原位杂交技术E.cDNA表达芯片技术正确答案:E7、问答题描述HIV的复制过程。
正确答案:HIV病毒属于双正链RNA病毒。
其复制是一个特殊而复杂的过程。
首先,HIV病毒体的包膜糖蛋白刺突先与细胞上的特异性受体结合,然后病毒包膜与细胞膜发生融合。
其次,核衣壳进入细胞质内脱壳释放其核心RNA以进行复制。
病毒的逆转录酶以病毒RNA为模板,合成负链DNA,构成RNA:DNA中间体,RNA链由RNA酶H水解去除,然后再由负链DNA合成正链DNA,并形成双链DNA,此时基因组的两端形成LT序列,并由细胞质移行到细胞核内。
再次,在病毒整合酶的作用下,病毒基因组整合到宿主染色体中,这种整合了病毒双链DNA称为前病毒。
当病毒活化时在LTR作用下进行自身转录。
基因诊断
基因诊断Gene diagnosis第一节概述⏹基因变异致病可分为两种主要类型⏹1 内源基因的变异:由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响,人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常,从而导致疾病。
⏹2 外源基因的入侵:如各种病原体感染人体后,其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。
一、基因诊断的概念所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。
二、基因诊断的特点1.以基因作为检查材料和探查目标,属于“病因诊断”,针对性强。
2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针,故具有很高的特异性。
3.由于分子杂交和聚合酶链反应(PCR)技术都具有放大效应,故诊断灵敏度很高。
4.适用性强,诊断范围广。
5.检测外源基因时,可以检测出潜伏的病原体。
三、基因诊断的临床意义⏹1.可以更加准确的对遗传性疾病作出诊断,对了解发病过程和机制,为疾病的分类和分型,以及最终治疗这些疾病提供理论依据。
⏹2.进行产前基因诊断,提高人口素质⏹3.进行病原体的流行病学检查。
⏹4.更好的完成组织配型,提高器官移植的成功率。
第二节基因诊断的原理⏹一、人类基因的结构:⏹二、基因的表达与突变基因的突变类型⏹(一)大片断缺失或插入突变⏹(二)移码突变⏹(三)点突变(point mutation)⏹染色体易位、基因重排、基因扩增等。
第三节基因诊断的常用技术方法(一)核酸分子杂交技术⏹限制性内切酶谱分析法⏹DNA限制性长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism, RLFP)分析⏹等位基因特异寡核苷酸探针(allele specificoligonucleotide, ASO)(二)聚合酶链反应(PCR)(三)基因测序(四)基因芯片1、限制性内切酶酶谱分析法 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。
聚合酶链式反应 PCR
19
5' 3'
3' 5' 5' 3'
3' 5'
M
1
2
3
4
20
(3)单链构象多态性
(signle strand conformation polymorphism,SSCP)
概念:单链DNA由于碱基序列的不同可引
起构象差异,这种差异将造成相同或相近长度 的单链DNA电泳迁移率不同,从而可用于DNA中 单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。 可检’
D
2
5’
1 U
2
3’
D
15
2
5’
1 P1
2
1
2 P3
1 P4
θ 3’
--SEA -α3.7 -α4.2
P2
16
(2) 等位基因特性PCR
(allele-specific pcr,ASPCR)
ASPCR:也称为扩增阻碍突变系统
(amplification refractory mutation system,ARMS)
32
Allele II 产生了新的酶切点
12Kb
Allele I
8Kb 4Kb
12Kb 8Kb
Allele II probe
RFLP—Southern blot检测结果
33
实例1
实例 2 长 QT间期综合征
LQTS多数由单 个氨基酸臵换引 起,本系谱显示 的是HERG 基因 371 位臵T→C 臵 换,PCR产物采用 AccII酶解后,产 生138 bp 片断。
解链 构像
1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
24
分离培养方法结合PCR—SSCP技术分析六神曲中的真菌类群
分离培养方法结合PCR—SSCP技术分析六神曲中的真菌类群目的:采用传统分离培养方法结合PCR-SSCP技术对六神曲中的真菌类群进行分析,为全面了解六神曲中的功能菌群奠定基础。
方法:采用直接分离法获得六神曲中的可培养真菌,根据形态学及DNA序列特征对得到的真菌进行鉴定;同时提取六神曲中真菌的总DNA,采用基于β-tubulin基因片段的聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析其中所包含的真菌种类。
结果:采用传统分离培养的方法,从生神曲中只得到黄曲霉Aspergillus flavus和米根霉Rhizopus oryzae;从焦神曲中得到黄曲霉A. flavus和黑曲霉A. niger。
PCR-SSCP 分析结果显示生神曲中含有3属5种真菌,其中A. ambiguus以及A. ivoriensis 占优势,相对多度分别为57%,35%,与培养方法共有的种类为A. flavus,相对多度仅为4%;但未从焦神曲中获得阳性克隆。
结论:在六神曲中的真菌多样性分析中,通过PCR-SSCP分析技术能从DNA水平上发现传统分离培养方法无法获得的真菌种类,结合2种方法可以更全面地解析参与六神曲发酵的功能真菌。
标签:六神曲;可培养真菌;β-tubulin基因;PCR-SSCP技术;真菌类群六神曲又名六曲、神曲,是一味应用历史悠久的曲类中药,由面粉或麸皮、赤小豆、苦杏仁、鲜青蒿、鲜苍耳、鲜辣蓼等按一定比例混匀后发酵而成。
最早收载于《药性论》中,味甘、辛,性温,归脾、胃经。
具有健脾和胃,消食调中的功效。
用于治疗饮食停滞,胸痞腹胀,呕吐泻痢,产后瘀血腹痛,小儿腹大坚积等[1]。
另外临床研究还表明神曲具有良好的肠道菌群调整作用和肠保护作用[2]。
神曲除了直接应用于临床,还是中成药特别是含发酵类药材中成药的主要原材料,在2010年版《中国药典》收录的含发酵类药材中成药中超过80%(85种)含神曲成分[3]。
【国家自然科学基金】_聚合酶链反应-单链构象多态性_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
2011年 科研热词 推荐指数 脑出血 2 高密度脂蛋白胆固醇 1 限制性片段长度多态性 1 遗传学 1 遗传变异 1 转录因子 1 衰老 1 苯丙酮尿症 1 苯丙氨酸羟化酶 1 脑梗死 1 胃癌 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 突变 1 磷脂酰胆碱-甾醇o-酰基转移酶 1 毛细管电泳 1 杂合缺失 1 房室传导阻滞 1 心血管病学 1 心房颤动 1 心律失常 1 多态现象 1 多态性,单核苷酸 1 基因突变 1 基因 1 垂体同型框2 1 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 1 单链构象多态性 1 卒中 1 动脉粥样硬化 1 scn5a 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
科研热词 推荐指数 非息肉病性结直肠癌 1 遗传多样性 1 遗传 1 西洋参 1 脂联素 1 胰岛素抵抗 1 聚合酶链反应-单链构象多态性 1 糖尿病 1 牦牛乳 1 汉族 1 心率失常 1 微卫星不稳定 1 多态现象 1 基因 1 危险因素 1 单核苷酸多态性 1 克山病 1 人参 1 α -乳白蛋白 1 scn5a基因 1 pcr-sscp 1 its序列 1 dna错配修复 1 2型 1
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
科研热词 推荐指数 聚合酶链反应-单链构象多态性 2 基因突变 2 黄芩苷 1 高血压 1 高胆固醇血症,家族性 1 高胆固醇血症 1 骨髓增生异常综合征 1 聚合酶链反应-单链构象多态性分析 1 聚合酶链反应 1 缓激肽β 2受体基因 1 紫癜,血小板减少性,特发性 1 特发性扩张型心肌病 1 点突变 1 溃疡性结肠炎 1 心肌肌钙蛋白t基因 1 微卫星不稳定 1 家族性 1 多态现象,遗传 1 多态现象,单链构象 1 外显子 1 基因多态性 1 基因,nras 1 基因,fms 1 哈萨克族 1 受体,ldl 1 凋亡 1 低密度脂蛋白受体 1 micb基因 1
用聚合酶链反应单链构象多态性分析技术检测结核分枝杆菌L型的rpoB基因突变
用聚合酶链反应单链构象多态性分析技术检测结核分枝杆菌L型的rpoB基因突变陆军;李卫鹏;叶松【期刊名称】《中国卫生检验杂志》【年(卷),期】2008(18)3【摘要】目的:探索结核分枝杆菌L型的耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系,以及聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术的临床应用价值。
方法:收集结核分枝杆菌L型菌株52株,采用PCR-SSCP方法检测rpoB基因,与采用常规药敏试验法检测利福平耐药的结果进行对比分析。
结果:采用常规法检测,52株临床分离株中有38株利福平耐药,耐药率为73.08%(38/52);PCR-SSCP方法对52株临床耐药株rpoB基因突变的检出率为65.38%(32/52),两种方法检测耐利福平的符合率为84.21%。
结论:PCR-SSCP对利福平耐药的结核分枝杆菌L型菌株检出率较高,将其与常规药敏试验联合应用,是一种指导临床用药的好方法。
【总页数】3页(P420-421)【关键词】结核分枝杆菌L型;rpoB基因;聚合酶链反应单链构象多态性分析【作者】陆军;李卫鹏;叶松【作者单位】安徽理工大学医学院;蚌埠医学院附属医院【正文语种】中文【中图分类】R378.911【相关文献】1.聚合酶链反应-单链构象多态性技术检测耐多药结核分支杆菌rpoB、KatG、rpsL突变的研究 [J], 黄四邑;邱望龙;潘智灵;李福元2.聚合酶链反应-单链构象多态性检测利福平结核分子杆菌rpoB基因突变 [J], 郭悦鹏;韩宇;曹青山;王改3.银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变 [J], 金铃;康熙雄;鱼瑛4.多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌 [J], 程晓东;于文彬;别良峰;苏明权;张荣;郝晓柯5.聚合酶链反应-冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变 [J], 汪谋岳因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
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聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP) 实验聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年来发展起来的一种基因分析方法。
PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。
在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。
这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。
相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。
PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含单碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。
由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR-SSCP技术,各有其优势及适用领域。
例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。
这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。
在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影显示结果。
利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。
二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。
本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。
一、试剂准备⒈PCR相关试剂⒉α-32P-dCTP⒊30%聚丙烯酰胺(29:1):丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g,溶于100ml ddH2O中,4 OC保存。
⒋10%过硫酸胺配制方法:1g 过硫酸胺,溶于10ml ddH2O中,4 OC保存(可用数周)。
⒌TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)⒍5×TBE缓冲液:Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。
7.变性上样液:95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步骤⒈PCR扩增反应总体积为10μl,在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分:10×buffer 1μldNTPmix 70μMDNA模板100ng引物及Taq DNA酶依实验设计要求按比例加入α-32P-dCTP 0.1μl加ddH2O至10μl按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。
⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴电泳槽玻璃板的处理:用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。
用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上,5~10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。
在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐,用固定夹夹紧两块玻璃,并用玻璃胶带封边。
⑵制胶:按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用5%~8%的凝胶较为合适。
轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气(开始时要缓慢)除气泡,加35μl TEMED 至聚丙烯酰胺混合液中,混匀。
用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液,将玻璃模具倾斜成60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。
立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。
由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。
将封口玻璃胶带掀去,放入电泳槽,凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽,用大号固定夹固定住两侧。
在上下电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。
小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
⑶扩增产物的处理:将PCR扩增产物与变性上样液按1:5的比例加入0.5ml微量离心管中,混匀。
样品上胶前应98 o C变性10min,立即冰浴骤冷。
取约3~5μl变性样品(根据点样孔的大小决定上样量),以微量加样器上样,(上样时要注意不要有气泡冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散)。
⑷电泳:电泳槽接上电极(上槽接负极,下槽接正极)开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。
通常室温下以l~5V/cm电泳。
⑸剥胶:电泳结束后,倒弃电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。
剪一张与玻璃同样大小的滤纸,严密覆盖于凝胶上,顺一个方向将凝胶缓慢取下,用保鲜膜盖于胶面并包好,避免膜和胶之间产生气泡或皱折,将凝胶固定在X线片夹中。
⑹放射自显影:在暗室中将X线片贴于胶面,盖严片夹,用黑布将X线片夹包裹,置-70OC放射自显影。
曝光时间根据同位素的强度而定,约24h~10d。
⑺冲洗胶片从-70oC取出X线片夹,在暗室内迅速取出X线片,立即显影,以免使X线片上出现过多的冷凝水。
(如果想再得到一张放射自显影影像,可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。
如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温,并擦去冷凝水后再装入新的X线片)。
依次按以下程序操作进行显影:X线片显影液显影1-5min水洗lmin定影液定影5min流动水冲洗15min所有使用液的温度应为18~20OC为宜。
三、注意事项⒈核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高。
对于<200bp的片段,SSCP 可发现其中70%的变异;对于300bP左右的片段则只能发现其中50%的变异;而>500bp的片段,则仅能检出10%~3O%的变异,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。
对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理,可以用限制性酶消化PCR产物,产生小于400bP的DNA 片段,再进行SSCP分析。
⒉游离引物: 游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响。
因此,应尽可能除去游离引物。
可以采用不对称引物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。
也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。
或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰。
⒊低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%-10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因为轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。
但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。
因此,对同一序列使用2~3种条件做SSCP,可能提高敏感性。
⒋电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出。
室温下电泳适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷却或循环水冷却等。
⒌凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析,凝胶板长度在40cm以上。
⒍凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重要,一般使用5%~8%的凝胶,凝胶浓度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。
凝胶的厚度对SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝胶越薄越好。
⒎假阴性: 一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。
如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带。
由于PCR-SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。
应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。
但对未知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。
8. 结果分析: 单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链带。
PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。
如变性不彻底,残留双链亦可形成一条带.因此,PCR-SSCP分析结果至少显示三条带。
但是,由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足为奇。