聚合酶链式反应

实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术

【实验目的】

掌握PCR反应的原理及操作技术。

【实验原理】

PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。

【器材与试剂】

1．器材

DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统

2．材料

模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。

3．试剂

(1) 10×PCR 缓冲液

(2) MgCl2 15mmol/L

(3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L

(4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl

(5) 引物1和引物2：2 μmol/L

(6) 琼脂糖凝胶电泳试剂

【操作步骤】

1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。

ddH2O 7.8 μl

10×PCR 缓冲液 2 μl

MgCl2（15mmol/L） 2 μl

dNTP（2.5mmol/L） 2 μl

引物1 (2μmol/L) 2 μl

引物2 (2μmol/L) 2 μl

模板DNA 2 μl

Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl

总体积20 μl

2．按下述循环程序进行扩增

程序阶段程序名称温度时间循环数

1 预变性94℃ 3 min 1

变性94℃30 sec

2 退火52℃30 sec

30

延伸72℃30 sec

3 保温4℃∞ 1

3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。

【要点提示】

1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94~95℃下30~60sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。

2．退火温度一般在45~55℃。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。。

3．延伸温度一般在70~75℃。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。

4．引物长度通常用20bp左右。两个引物扩增的片段大小300~500bp为宜。【思考题】

1、PCR反应的原理是什么？

2、如何确定PCR反应中的退火温度和延伸时间？