PCR聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
pcr反应的基本原理
pcr反应的基本原理PCR反应的基本原理PCR（聚合酶链式反应）是一种高效、快速、敏感的分子生物学技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、法医学等领域。
PCR反应的基本原理是通过体外复制DNA的方法，将少量的DNA模板扩增为大量的DNA产物。
PCR反应的基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应的变性步骤。
在PCR反应开始时，将反应体系中的DNA 模板暴露在高温条件下，通常为94-98摄氏度。
高温的作用是分离DNA双链，使其变为两个单链DNA。
这一步骤是通过破坏氢键来实现的，使DNA双链变为两个单链，使得DNA模板可以用作后续的扩增。
接下来是PCR反应的退火步骤。
在退火步骤中，温度降低至50-65摄氏度。
在这个温度范围内，引物（即PCR反应中的两个短DNA 片段）与DNA模板的互补序列结合。
引物是设计用来与DNA模板的特定区域互补配对的DNA片段。
在每个PCR循环中，引物与DNA模板结合，并指导DNA聚合酶酶链反应的进行。
最后是PCR反应的延伸步骤。
延伸步骤是在退火步骤的温度下进行的，在延伸步骤中，DNA聚合酶使用单链DNA模板作为模板，合成新的DNA链。
延伸的方向是从引物的3'端到5'端。
DNA聚合酶酶链反应需要四种核苷酸（即dATP、dCTP、dGTP和dTTP）作为构建新DNA链的原料。
在每个PCR循环中，引物结合到DNA模板上，DNA聚合酶在引物的指导下合成新的DNA链，从而扩增目标序列。
通过这样的变性、退火和延伸步骤的循环，PCR反应可以在短时间内扩增出大量的目标DNA序列。
每个PCR循环会产生2倍的DNA产物，因此PCR反应经过多个循环后，目标DNA序列的数量会呈指数级增加。
通常，在25-40个PCR循环后，可以获得足够数量的DNA产物进行进一步的分析和应用。
PCR反应的基本原理使其成为分子生物学研究中的重要工具。
通过PCR反应，可以从极少量的DNA样本中扩增出足够的DNA产物，以进行基因测序、基因突变检测、基因表达分析等。
聚合酶链式反应(PCR)实验方法
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
pcr的原理和步骤
pcr的原理和步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种基因扩增技术，可以通过复制DNA片段来产生大量的特定DNA序列。
PCR的原理和步骤
如下：
原理：
PCR基于DNA的体外扩增，使用DNA聚合酶来合成新的
DNA链。
其过程可以概括为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
这些步骤在不同温度下进行，使用特定的引物来定向扩增目标DNA序列。
步骤：
1. 变性（Denaturation）：将含有所需DNA片段的DNA模板
加热至94-98℃的高温，使双链DNA解链成两条单链。
在此
过程中，氢键断裂，使两条链分离。
2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65℃，使引物与单链DNA模板的互补序列结合。
引物是DNA的短片段，其中一段序列与目标DNA序列的两端相互衔接。
3. 延伸（Extension）：将温度升高至72℃，加入DNA聚合酶
和足够的核苷酸（dNTPs），使DNA聚合酶沿着引物的互补
序列合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够识别引物上的碱基对，并在其基础上合成新的DNA链。
此过程会在每一个DNA模
板两端的引物上进行。
以上步骤组成了PCR的一个循环。
通常，PCR会进行多个循
环，每个循环使DNA的数量翻倍，从而快速扩增目标DNA 序列。
PCR的结果是产生大量特定的DNA片段，可以用于分析、测序、克隆等应用。
PCR(聚合酶链式反应)技术与应用
PCR（聚合酶链式反应）技术与应用一．PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。
其反应原理与细胞内DNA复制相似，但PCR反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。
PCR包括下列三步反应：（1）变性（denaturation）：将反应体系混合物加热到94℃维持较短时间（大约15~30s），是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
（2）退火（annealing）：将反应体系冷却至特定温度（引物的T m值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。
必须精确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。
由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
（3）延伸（elongation）：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。
因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
以上三步作为一个循环重复进行，每一个循环的产物作为下一循环的模板。
因此，在第二轮循环中进行变性、退火、延伸这三步反应。
如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。
而所有上述过程将在1~2h内完成。
经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度。
聚合酶链式反应PCR
PCR - 1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应PCR - 技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP(dNTPdNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。
是包括dATP, dGTP, dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。
在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR（reverse transcription PCR）、Real-time PCR）中起原料作用。
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
什么是PCR
什么是PCR？定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis 在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis 也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。
也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。
pcr反应的名词解释
pcr反应的名词解释PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于在体外扩增DNA片段。
PCR技术可以在较短的时间内复制和扩增DNA片段，因此在医学、生物学、犯罪学和进化生物学等领域被广泛应用。
以下是27个双语例句：1. PCR amplifies specific DNA fragments in vitro.PCR在体外扩增特定的DNA片段。
2. The use of PCR has revolutionized molecular biology research.PCR的应用彻底改变了分子生物学研究。
3. PCR technology allows for quick and efficient DNA amplification.PCR技术可以快速高效地扩增DNA。
4. The PCR reaction requires a DNA template, primers, nucleotides, and DNA polymerase.PCR反应需要DNA模板、引物、核苷酸和DNA聚合酶。
5. The denaturation step in PCR involves heating the DNA to separate the strands.PCR中的变性步骤是通过加热DNA来使两股DNA分离。
6. Annealing is the process of binding the primers to their complementary DNA sequences.等温是指引物与其互补的DNA序列结合的过程。
7. Extension is the step in PCR where DNA polymerase synthesizes new DNA strands.延伸是PCR中DNA聚合酶合成新的DNA链的步骤。
8. PCR amplification can be done using a thermal cycler machine.可以使用热循环机进行PCR扩增。
pcr聚合酶链式反应
第3P轮CR反扩应增条件
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增第5轮扩增
第6轮扩增
.
15
3.PCR基本材料
①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
.
11
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程
7925℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始.12Fra bibliotek PCR的基本原理
Taq
PPCCRR反过应程条件957502℃
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
.
13
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程
72℃
PCR的特点
第2轮结束
.
14
模板DNA
第1轮扩增
最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。
.
8
2.PCR工作方式
95℃
模板DNA
.
9
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PCR反应条件 PCR过程
95℃
PCR的特点
引物1
50℃
.
10
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程
5702℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
.
21
5.PCR要素解析
④模板：单、双链DNA均可。 模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过 高会导致反应的非特异性增加。
聚合酶链式反应pcr
聚合酶链式反应pcr
1 聚合酶链式反应PCR
聚合酶链式反应（PCR）是一种允许大量翻倍指定的DNA序列的分
子生物技术。
通过利用特殊的酶（聚合酶）将两个DNA片段分别相互“拉伸”，重复地迭代扩增，合成更长的片段。
1.1 PCR的原理
PCR主要利用DNA聚合酶的功能来调控DNA片段的重复扩增与合成。
扩增过程分为三个步骤，即引物扩增、双螺旋扩增、保守分裂。
引物
扩增过程中，首先将扩增片段与反转录引物结合起来，DNA聚合酶将其复制到双螺旋结构；双螺旋扩增过程中，DNA聚合酶会主动分裂双螺旋，然后重复复制双螺旋，产生DNA序列的复制品；最后，保守分裂过程中，会继续分裂DNA双螺旋，直到完成指定的扩增任务。
1.2 PCR的应用
PCR技术有着广泛的应用，主要包括临床诊断应用、筛检、疾病分子检测等。
其中，PCR已经被广泛应用在心脑血管疾病、肿瘤、感染性疾病以及遗传病的检测上，准确可靠地检测出各种疾病的抗原。
另外，PCR技术在基因组学研究中也有广泛应用，可以用来进行基因鉴定、基因表达研究、比较基因组研究等。
在微生物学研究中，PCR技术也可以用来识别和遗传分类各种细菌和病毒，可以研究它们的源头和传播路径。
由此可见，聚合酶链式反应PCR技术无疑是一种重要而有用的分子生物技术，它已经得到广泛的应用，在诊断、疾病研究以及基因组学研究中发挥着重要作用。
PCR介绍,生物学的聚合酶链式反应
生物学的聚合酶链式反应定义：一种在体外扩增DNA片段的重要技术。
当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，痕量模板DNA可扩增至几百万倍。
聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。
已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。
复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。
PCR发明不到10年，却已获得广泛应用。
每年都有上千篇文章发表。
1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶在适当温度下的体外酶促反应，在较短时间内大量复制目标DNA片段，并使其扩增至可检测水平。
PCR包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤使DNA双链解开成两股单链，退火步骤使引物与目标DNA特异性结合，延伸步骤利用DNA聚合酶在合适温度下合成新DNA链。
这三个步骤连续循环进行，每一轮都会产生双倍数量的目标DNA。
PCR具有高度特异性、高灵敏性和高速度的特点，可以从少量的起始DNA样品中扩增出目标DNA片段，常用于分子生物学研究中的DNA定量、基因检测、基因测序、基因工程等多个领域。
PCR
PCR自测题一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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➢PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片 段，有许多缺点。
➢1988年Saiki 等使用Taq DNA聚合酶，它具 有较强的耐热性，使PCR能广泛的应用。
大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片断
Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶裂解完整 的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′ 外切酶的活性所得到的片段。分子量76kD。主 要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链 DNA3′端标记。
Klenow片段在PCR反应中的缺点： 1、DNA变性时酶酶不耐热而失活。 2、反应温度低，形成DNA二级结构。 3、引物非特异性退火。 4、反应效率低，易出现非特异性产物。
复制叉移动方向 解旋酶
DNA聚合酶
DNA旋转酶 ATP
ADP+Pi DNA结合蛋白 引物RNA 引物酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
RNA引物
3， 5，
DNA连 接 酶
3， 5，
5
3
AG T G A T C A G A
3
T C A 5
5
TCT
G
O H
P
P
P
HO
P-PP
dTTP dATP dCTP
3'
5' 领头链
5'
5'
解链方向
3'
随从链
3' 5'
用复制方向与解链方向不一致以理解 不连续复制的成因
5'
5' RNA酶
5'
5'
OH
P
Pol I
5'
5'
连接酶
AБайду номын сангаасP P
ADP
5'
5'
图11-20 引物的取代和连接酶的接合作用 ~~代表引物
聚合酶链反应简介
➢PCR是80年建立的体外核酸扩增技术。 ➢具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复
OH
5 3
复制过程的脱氧核苷酸聚合 带斜线的小方框代表引物
DNApol I
外切活性 聚合活性
A dCTP
5
3
G
DNA-pol I无活性
5
C
3
G
DNApol I的校读功能
上：DNApol I的外切酶活性切除错配碱基，
并用其聚合酶活性参入正确配对的底物
下： 碱基配对正确，DNA-pol I不表现活性
Taq DNA聚合酶
该酶的特点： 1、95℃不易失活。 2、引物退火与延伸可在较高温度进行。 3、3’末端加A。 4、反转录活性。 5、改造的Taq酶，长链合成，>20kb。
PCR技术的基本原理
1、类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤 构成： ➢ 变性：93℃左右，双链DNA解离成为单链； ➢ 退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单 链的互补序列配对结合；
分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。4种dNTP的浓度要
相等，其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏 高或偏低)，就会引起错配。 ➢浓度过低又会降低PCR产物的产量。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低。
其它序列无明显同源性（70%）。 8、进行计算机辅助设计。
引物量
➢每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol （每100ul反应），以最低引物量产生所需要 的结果为好。
➢原因：引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩 增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度
➢75℃时TaqDNA聚合酶的比活性： 150bp/s/酶分子。
性好、易自动化等优点。 ➢能在一个试管内将所要研究的目的基因于数小时
内扩增至百万倍。 ➢可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出
足量的DNA供分析研究。 ➢PCR技术是生物医学领域中的里程碑。
技术简史
➢PCR的最早设想 ：Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变 性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延 伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因”。
聚合酶链式反应
体内DNA复制过程
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
通过半保留复制，子代DNA和亲代的 DNA是一致的
参与体内DNA复制的酶
DNA聚合酶 解链酶 拓扑酶 SSB 引物酶 连接酶
5， 3，
DNA复制过程模式图
➢延伸：TaqDNA酶以dNTP为反应原料，靶序 列为模板，按碱基配对合成一条新的与模板 互补的DNA 链。
3、重复循环：变性--退火--延伸，获得更多的 DNA模板。
4、一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
DNA天然复制的基本要素
1、DNA聚合酶 2、DNA连接酶 3、DNA模板 4、由引发酶合成的RNA引物 5、核苷酸原料 6、无机离子 7、合适的pH 8、蛋白质因子 9、解开DNA的超螺旋及双螺旋酶
2、引物扩增跨度：200-500bp，特定条件下可 扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量为40-60%，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
4、避免引物内部出现二级结构；避免引物间互 补尤其是3`端的互补。
5、引物3`端的碱基，特别是最末两个碱基，严 格配对。
6、引物5’端可加上合适的酶切位点。 7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
➢ 10×扩增缓冲液 10ul
➢ 4种dNTP混合物 各200umol/L
➢ 引物
各10～100pmol
➢ 模板DNA
0.1～2ug
➢ Taq DNA聚合酶 2.5u
➢ Mg2+
1.5mmol/L
➢ 加双或三蒸水至 100ul
引物设计原则
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 （416=4.29 X109 >3X109) 。
➢通常，每次循环的中产生的移码突变率约为 1/30000，碱基突变率约为1/8000。
➢酶催化合成的忠实性：低浓度dNTP和 1.5mmol/L Mg2+, >55℃复性可提高忠实性。
➢催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U/100ul， 浓度过高可引起非特异性扩增。
dNTP的质量与浓度
➢dNTP质量与PCR扩增效率有密切关系。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量