PCR聚合酶链式反应
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其它序列无明显同源性（70%）。 8、进行计算机辅助设计。
引物量
➢每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol （每100ul反应），以最低引物量产生所需要 的结果为好。
➢原因：引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩 增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度
➢75℃时TaqDNA聚合酶的比活性： 150bp/s/酶分子。
复制叉移动方向 解旋酶
DNA聚合酶
DNA旋转酶 ATP
ADP+Pi DNA结合蛋白 引物RNA 引物酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
RNA引物
3， 5，
DNA连 接 酶
3， 5，
5
3
AG T G A T C A G A
3
T C A 5
5
TCT
G
O H
P
P
P
HO
P-PP
dTTP dATP dCTP
性好、易自动化等优点。 ➢能在一个试管内将所要研究的目的基因于数小时
内扩增至百万倍。 ➢可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出
足量的DNA供分析研究。 ➢PCR技术是生物医学领域中的里程碑。
技术简史
➢PCR的最早设想 ：Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变 性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延 伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因”。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
➢ 10×扩增缓冲液 10ul
➢ 4种dNTP混合物 各200umol/L
➢ 引物
各10～100pmol
➢ 模板DNA
0.1～2ug
➢ Taq DNA聚合酶 2.5u
➢ Mg2+
1.5mmol/L
➢ 加双或三蒸水至 100ul
引物设计原则
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 （416=4.29 X109 >3X109) 。
2、引物扩增跨度：200-500bp，特定条件下可 扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量为40-60%，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
4、避免引物内部出现二级结构；避免引物间互 补尤其是3`端的互补。
5、引物3`端的碱基，特别是最末两个碱基，严 格配对。
6、引物5’端可加上合适的酶切位点。 7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的
分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。4种dNTP的浓度要
相等，其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏 高或偏低)，就会引起错配。 ➢浓度过低又会降低PCR产物的产量。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低。
聚合酶链式反应
体内DNA复制过程
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
A
T
C
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T
A
T
A
A
T
G
C
Baidu Nhomakorabea
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
通过半保留复制，子代DNA和亲代的 DNA是一致的
参与体内DNA复制的酶
DNA聚合酶 解链酶 拓扑酶 SSB 引物酶 连接酶
5， 3，
DNA复制过程模式图
➢PCR的实现： 1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis 等发明了聚合酶 链反应。
➢PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片 段，有许多缺点。
➢1988年Saiki 等使用Taq DNA聚合酶，它具 有较强的耐热性，使PCR能广泛的应用。
Taq DNA聚合酶
该酶的特点： 1、95℃不易失活。 2、引物退火与延伸可在较高温度进行。 3、3’末端加A。 4、反转录活性。 5、改造的Taq酶，长链合成，>20kb。
PCR技术的基本原理
1、类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤 构成： ➢ 变性：93℃左右，双链DNA解离成为单链； ➢ 退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单 链的互补序列配对结合；
大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片断
Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶裂解完整 的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′ 外切酶的活性所得到的片段。分子量76kD。主 要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链 DNA3′端标记。
Klenow片段在PCR反应中的缺点： 1、DNA变性时酶酶不耐热而失活。 2、反应温度低，形成DNA二级结构。 3、引物非特异性退火。 4、反应效率低，易出现非特异性产物。
OH
5 3
复制过程的脱氧核苷酸聚合 带斜线的小方框代表引物
DNApol I
外切活性 聚合活性
A dCTP
5
3
G
DNA-pol I无活性
5
C
3
G
DNApol I的校读功能
上：DNApol I的外切酶活性切除错配碱基，
并用其聚合酶活性参入正确配对的底物
下： 碱基配对正确，DNA-pol I不表现活性
➢延伸：TaqDNA酶以dNTP为反应原料，靶序 列为模板，按碱基配对合成一条新的与模板 互补的DNA 链。
3、重复循环：变性--退火--延伸，获得更多的 DNA模板。
4、一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
DNA天然复制的基本要素
1、DNA聚合酶 2、DNA连接酶 3、DNA模板 4、由引发酶合成的RNA引物 5、核苷酸原料 6、无机离子 7、合适的pH 8、蛋白质因子 9、解开DNA的超螺旋及双螺旋酶
3'
5' 领头链
5'
5'
解链方向
3'
随从链
3' 5'
用复制方向与解链方向不一致以理解 不连续复制的成因
5'
5' RNA酶
5'
5'
OH
P
Pol I
5'
5'
连接酶
ATP P
ADP
5'
5'
图11-20 引物的取代和连接酶的接合作用 ~~代表引物
聚合酶链反应简介
➢PCR是80年建立的体外核酸扩增技术。 ➢具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复
➢通常，每次循环的中产生的移码突变率约为 1/30000，碱基突变率约为1/8000。
➢酶催化合成的忠实性：低浓度dNTP和 1.5mmol/L Mg2+, >55℃复性可提高忠实性。
➢催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U/100ul， 浓度过高可引起非特异性扩增。
dNTP的质量与浓度
➢dNTP质量与PCR扩增效率有密切关系。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量
引物量
➢每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol （每100ul反应），以最低引物量产生所需要 的结果为好。
➢原因：引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩 增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度
➢75℃时TaqDNA聚合酶的比活性： 150bp/s/酶分子。
复制叉移动方向 解旋酶
DNA聚合酶
DNA旋转酶 ATP
ADP+Pi DNA结合蛋白 引物RNA 引物酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
RNA引物
3， 5，
DNA连 接 酶
3， 5，
5
3
AG T G A T C A G A
3
T C A 5
5
TCT
G
O H
P
P
P
HO
P-PP
dTTP dATP dCTP
性好、易自动化等优点。 ➢能在一个试管内将所要研究的目的基因于数小时
内扩增至百万倍。 ➢可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出
足量的DNA供分析研究。 ➢PCR技术是生物医学领域中的里程碑。
技术简史
➢PCR的最早设想 ：Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变 性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延 伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因”。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
➢ 10×扩增缓冲液 10ul
➢ 4种dNTP混合物 各200umol/L
➢ 引物
各10～100pmol
➢ 模板DNA
0.1～2ug
➢ Taq DNA聚合酶 2.5u
➢ Mg2+
1.5mmol/L
➢ 加双或三蒸水至 100ul
引物设计原则
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 （416=4.29 X109 >3X109) 。
2、引物扩增跨度：200-500bp，特定条件下可 扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量为40-60%，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
4、避免引物内部出现二级结构；避免引物间互 补尤其是3`端的互补。
5、引物3`端的碱基，特别是最末两个碱基，严 格配对。
6、引物5’端可加上合适的酶切位点。 7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的
分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。4种dNTP的浓度要
相等，其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏 高或偏低)，就会引起错配。 ➢浓度过低又会降低PCR产物的产量。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低。
聚合酶链式反应
体内DNA复制过程
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
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A
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G
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A
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Baidu Nhomakorabea
A
T
G
C
A
T
A
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A
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G
C
通过半保留复制，子代DNA和亲代的 DNA是一致的
参与体内DNA复制的酶
DNA聚合酶 解链酶 拓扑酶 SSB 引物酶 连接酶
5， 3，
DNA复制过程模式图
➢PCR的实现： 1985年美国PE-Cetus公司 人类遗传研究室的Mullis 等发明了聚合酶 链反应。
➢PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片 段，有许多缺点。
➢1988年Saiki 等使用Taq DNA聚合酶，它具 有较强的耐热性，使PCR能广泛的应用。
Taq DNA聚合酶
该酶的特点： 1、95℃不易失活。 2、引物退火与延伸可在较高温度进行。 3、3’末端加A。 4、反转录活性。 5、改造的Taq酶，长链合成，>20kb。
PCR技术的基本原理
1、类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤 构成： ➢ 变性：93℃左右，双链DNA解离成为单链； ➢ 退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单 链的互补序列配对结合；
大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片断
Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶裂解完整 的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′ 外切酶的活性所得到的片段。分子量76kD。主 要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链 DNA3′端标记。
Klenow片段在PCR反应中的缺点： 1、DNA变性时酶酶不耐热而失活。 2、反应温度低，形成DNA二级结构。 3、引物非特异性退火。 4、反应效率低，易出现非特异性产物。
OH
5 3
复制过程的脱氧核苷酸聚合 带斜线的小方框代表引物
DNApol I
外切活性 聚合活性
A dCTP
5
3
G
DNA-pol I无活性
5
C
3
G
DNApol I的校读功能
上：DNApol I的外切酶活性切除错配碱基，
并用其聚合酶活性参入正确配对的底物
下： 碱基配对正确，DNA-pol I不表现活性
➢延伸：TaqDNA酶以dNTP为反应原料，靶序 列为模板，按碱基配对合成一条新的与模板 互补的DNA 链。
3、重复循环：变性--退火--延伸，获得更多的 DNA模板。
4、一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
DNA天然复制的基本要素
1、DNA聚合酶 2、DNA连接酶 3、DNA模板 4、由引发酶合成的RNA引物 5、核苷酸原料 6、无机离子 7、合适的pH 8、蛋白质因子 9、解开DNA的超螺旋及双螺旋酶
3'
5' 领头链
5'
5'
解链方向
3'
随从链
3' 5'
用复制方向与解链方向不一致以理解 不连续复制的成因
5'
5' RNA酶
5'
5'
OH
P
Pol I
5'
5'
连接酶
ATP P
ADP
5'
5'
图11-20 引物的取代和连接酶的接合作用 ~~代表引物
聚合酶链反应简介
➢PCR是80年建立的体外核酸扩增技术。 ➢具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复
➢通常，每次循环的中产生的移码突变率约为 1/30000，碱基突变率约为1/8000。
➢酶催化合成的忠实性：低浓度dNTP和 1.5mmol/L Mg2+, >55℃复性可提高忠实性。
➢催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U/100ul， 浓度过高可引起非特异性扩增。
dNTP的质量与浓度
➢dNTP质量与PCR扩增效率有密切关系。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量