聚合酶链反应技术(PCR)
pcr技术在分子生物学中的应用
pcr技术在分子生物学中的应用PCR技术在分子生物学中的应用引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以快速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术因其高效、灵敏和可靠的特点，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
本文将深入探讨PCR技术在分子生物学中的应用。
一、基因检测PCR技术在基因检测中有着重要的应用。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测个体是否携带某种基因突变或遗传病。
例如，PCR技术可以用于检测乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的突变，帮助判断个体是否具有遗传乳腺癌的风险。
此外，PCR技术还可以用于检测病原体的基因，例如新冠病毒的核酸检测就是基于PCR原理。
二、疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
通过PCR扩增患者体液中特定病原体的DNA或RNA片段，可以快速准确地检测出病原体的存在，从而帮助医生进行疾病的诊断。
例如，PCR技术可以用于检测艾滋病病毒的存在，帮助医生判断患者是否感染了艾滋病。
此外，PCR技术还可以用于检测细菌感染，例如通过检测脑脊液中的细菌DNA片段来诊断脑膜炎。
三、基因工程PCR技术在基因工程领域有着广泛的应用。
通过PCR扩增目标基因片段，可以快速获得大量的目标DNA。
这样就可以进行基因克隆、基因插入等操作。
例如，PCR技术可以用于构建重组质粒，将目标基因插入到质粒中，从而实现基因的表达和研究。
此外，PCR技术还可以用于基因突变的引入，通过引入特定突变的PCR产物，可以实现特定基因的突变。
四、法医学PCR技术在法医学中有着重要的应用。
通过PCR扩增样本中特定基因片段的DNA，可以对犯罪现场的DNA进行检测和鉴定。
例如，在刑事案件中，通过PCR技术可以检测凶手遗留在现场的DNA，从而确定凶手的身份。
此外，PCR技术还可以用于亲子鉴定，通过比对父母和子女的DNA片段，确定亲子关系。
总结：PCR技术作为一种高效、灵敏和可靠的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
PCR反应包括哪三个步骤的循环
PCR反应包括哪三个步骤的循环PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它通过体外扩增特定DNA 片段，使得微量的DNA能够被放大到足够多的数量，以便于进一步的分析。
PCR反应包括三个主要的步骤循环，即变性、退火和延伸。
变性在PCR的第一个循环中，模板DNA首先被加热至高温，使其双链DNA解开成两条单链。
这个步骤通常在94-98°C的高温下进行，因为高温能够使DNA双链断开并保持单链状态。
变性过程中，水样品中的DNA模板变成了单链的DNA，这为后续的扩增提供了可用的单链DNA作为反应的起点。
退火在退火的步骤中，温度被降低到使引物与单链DNA结合的最佳温度。
引物是设计用来与待扩增片段的两端互补的短DNA序列。
每个引物分别结合于目标序列的两端，它们会导致DNA链的延申。
当温度下降时，引物与目标序列的一部分进行互补结合。
这个步骤一般在50-65°C的退火温度下进行。
延伸在延伸步骤中，聚合酶通过引物的互补结合将新的DNA链合成。
温度被升高到使聚合酶能够在模板和引物之间进行反应的最佳温度，一般在72°C左右。
聚合酶通过与引物结合的模板DNA链进行配对、合成新的DNA链，并在延伸部位与引物解离后，将新的DNA链复制出来。
这个过程会导致DNA链的扩增，使其数量不断增加。
在第一轮扩增完成后，PCR反应会进行多个循环，从而使DNA的数量呈指数级增长。
每个循环包括以上三个步骤，从而使扩增的DNA数量倍增。
随着循环的进行，目标DNA片段的数量将迅速增加，并达到足够的数量以便于进一步的分析或应用。
总结而言，PCR反应是通过循环依次进行变性、退火和延伸步骤，使得DNA在体外被扩增的技术。
这种技术在分子生物学、医学以及其他领域中具有广泛的应用，例如基因检测、疾病诊断和DNA测序等。
通过PCR反应，科学家能够从微量的DNA样品中放大特定的DNA片段，从而方便后续的研究和分析。
pcr扩增的原理和步骤
pcr扩增的原理和步骤
PCR（聚合酶链反应）是一种用于体外扩增DNA的技术，它能够通过特定的引物和DNA聚合酶实现目标DNA序列的大量复制，使得微量的DNA可以在短时间内得到足够多的复制产物。
PCR的原理可以概括为三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
第一步是变性，即将所需扩增的DNA样本加热至94-98°C，使其双链DNA变为两条单链DNA。
此步骤会破坏氢键，使DNA分子解聚，并暴露出目标序列。
第二步是引物结合，通过在变性的DNA溶液中加入两个特异性的引物。
这两个引物的设计是相互互补的，并且定向分别与目标DNA序列的起始和终止位点结合。
引物与目标序列结合后，温度降低至50-65°C，使引物与带有目标序列的DNA分子发生特异性的酵素结合。
第三步是延伸，即在引物结合的条件下，通过在37-75°C之间的适宜温度下加入DNA聚合酶和适宜的核苷酸三磷酸，使DNA聚合酶从引物的3'末端起始位置开始合成新的DNA链。
在延伸过程中，DNA聚合酶沿着DNA模板链朝着反向方向进行复制，并合成与模板链互补的新链。
以上三个步骤构成了PCR扩增的基本过程，通过不断循环这三个步骤，可以使得目标DNA序列不断复制，并得到大量的
扩增产物。
每个PCR周期将使目标序列的数量成倍增加，因此，经过若干个PCR周期后，可以得到足够多的扩增产物用于后续的分析和应用。
pcr的原理及应用
pcr的原理及应用
PCR(聚合酶链反应)是一种常用的基因扩增技术，其原理是通过复制DNA模板来扩增目标DNA片段的数量。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在PCR反应开始时，通过将反应体系加热至95℃左右，DNA 双链分子会解旋成两条单链DNA。
然后，将反应温度降低至50-65℃，进入退火阶段。
在此温度下，引物(一对常规是20-30碱基的DNA片段)会与模板DNA的互补序列结合，形成DNA-RNA杂交体。
最后，将反应体系温度升高至72℃，此时酶Taq聚合酶能够在DNA模板上从引物的3'端向5'端逆向延伸，合成一条与模板DNA互补的新的DNA链。
PCR技术有广泛的应用。
首先，PCR常用于基因测序，可以扩增目标DNA片段，使其达到测序所需的足够数量。
此外，PCR也可用于检测基因突变、揭示疾病相关的遗传变异以及进行谱系分析。
另外，PCR还可用于鉴定DNA样本的来源，如在法庭上用作法医学证据。
此外，PCR也被广泛应用于生物学研究、医学诊断和农业领域等。
值得注意的是，在进行PCR实验时，需要严格控制反应条件和杂交引物的设计，以确保扩增的目标片段具有高度的专一性和准确性。
聚合酶链反应的原理和过程
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理和过程1. 引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR的原理基于DNA的复制过程，通过重复进行一系列的温度变化和酶催化反应，使得DNA模板序列得以扩增。
PCR技术的发展极大地促进了基因组学、遗传学、医学诊断和犯罪学等领域的研究。
2. PCR的基本原理PCR技术借助于DNA聚合酶这个酶来实现DNA片段的扩增。
其基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性首先，在高温条件下（通常为94-98摄氏度），将待扩增样品中的双链DNA解链成两条单链模板。
这一步被称为变性（Denaturation），其目的是打破氢键连接，使双链DNA分离成两条单链。
2.2 退火接下来，在较低温度（通常为50-65摄氏度），通过引入一组特异性的引物（即寡核苷酸引物，通常为20-30个碱基），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
这一步被称为退火（Annealing），其目的是将引物定位在待扩增的DNA序列上。
2.3 延伸最后，在适宜温度下（通常为72摄氏度），加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使其沿着引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
这一步被称为延伸（Extension）或扩增，其目的是合成与模板DNA相对应的新链。
通过重复进行上述三个步骤，PCR技术可以在相对短的时间内从少量起始DNA扩增出大量特定片段的DNA。
3. PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：3.1 DNA模板PCR反应需要待扩增的DNA片段作为模板。
模板可以是从细胞提取得到的基因组DNA、cDNA、质粒等。
3.2 引物PCR反应需要两条引物，分别位于待扩增序列的两端。
引物是由碱基组成的短链RNA或DNA分子，具有与待扩增序列互补的碱基序列。
引物的设计十分重要，需要确保其与待扩增序列的特异性结合，避免与其他非目标DNA结合。
pcr三个步骤
pcr三个步骤聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。
本文将详细介绍PCR的三个步骤及其在实验室中的应用。
一、变性PCR的第一个步骤是变性。
在这个步骤中，需要将待扩增的DNA模板加热至95摄氏度。
高温的作用是使双链DNA解链成两条单链DNA。
由于高温导致氢键断裂，DNA的双链结构会转变为单链结构。
这一过程通常需要较高的温度和一定的时间，以确保DNA完全解链。
二、退火退火是PCR的第二个步骤。
在这个步骤中，温度会降低至使引物与目标DNA序列进行结合的最佳温度。
引物是一种短的DNA片段，它会与目标DNA序列的两端互补配对。
通过引物的结合，可以指导DNA聚合酶在目标DNA序列起始位置上进行复制。
退火的温度通常会根据引物的碱基序列来确定。
引物的退火温度应该比目标DNA序列中较高的GC含量的碱基对的融点高一些。
这样才能保证引物在目标DNA序列上的特异性结合，避免非特异性引物结合带来的误差。
三、延伸PCR的第三个步骤是延伸。
在这个步骤中，温度会升高至聚合酶的最适工作温度（一般为72摄氏度）。
在此温度下，DNA聚合酶会在引物的指导下，以模板DNA为模板合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够在引物的末端开始合成，并向反方向复制整个DNA链，从而扩增目标DNA序列。
延伸的过程中需要将适当的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）提供给PCR反应体系，以供DNA聚合酶进行DNA合成。
该步骤的时间会根据待扩增的DNA片段的长度来设定，确保足够的时间完成DNA的合成。
PCR三个步骤的重复进行，可以在短时间内扩增一份DNA模板，并在最终产物中得到数以万计的复制。
PCR技术的应用PCR技术在分子生物学领域有着广泛的应用。
下面列举几个PCR技术的常见应用。
1. 基因检测：PCR技术可以用于基因检测，包括遗传病的检测、疾病易感性的评估等。
通过对特定基因序列的扩增，可以分析基因突变、单核苷酸多态性等关联因素。
pcr的原理特点及应用
PCR的原理特点及应用PCR概述聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，由基因工程师凯瑟琳·韦伯斯和尤尔·拉斯克于1983年开发。
PCR技术通过体外复制DNA片段的方法，在实验室中快速、高效地扩增特定的DNA序列，从而为其他分子生物学研究提供了重要工具。
下面将介绍PCR的原理、特点以及应用。
PCR原理PCR基于DNA的串联扩增原理，通过连续进行三个步骤来扩增目标DNA片段：变性、退火和延伸。
具体步骤如下：1.变性：将PCR反应体系中的DNA双链变性为两条单链DNA，这一步是通过加热样本混合物到94-98°C来实现的。
2.退火：将温度降低到50-65°C，引入与目标DNA片段互补的引物。
引物会与目标DNA的两端结合，即在目标DNA的5’端和3’端形成氢键。
3.延伸：增加DNA聚合酶酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），并将温度升高到72°C，允许DNA聚合酶能够在引物的基础上在目标DNA片段上合成新的DNA链。
通过重复这三个步骤，PCR可以在每个循环中产生两倍的目标DNA片段，从而在几个循环之后实现指数级扩增。
PCR的特点•快速高效：PCR具有扩增速度快、效率高的特点，只需数小时即可从少量模板DNA扩增至可检测的水平。
相比传统的细菌培养方法，PCR可以在更短的时间内得到大量的DNA片段。
•特异性强：PCR引物的设计可以通过碱基互补原理，使引物与目标DNA片段高度特异性地结合。
这种高度特异性的配对可以确保PCR扩增的是目标DNA片段，而不是其他非特异性DNA序列。
•可靠性好：PCR技术操作简单、重复性高，且结果可靠。
在实验室中，PCR已成为分子生物学研究和临床诊断中不可或缺的技术手段之一。
PCR的应用PCR技术在许多研究领域和应用中都扮演着重要角色。
以下是PCR常见应用的一些举例：1.基因克隆：PCR可以用于扩增需要进一步研究和分析的DNA片段。
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
聚合酶链式反应技术及其应用
聚合酶链式反应技术及其应用在生物科技领域，聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种非常重要的技术手段，它可以快速、准确地扩增DNA，应用广泛。
下面，我将详细介绍PCR技术的原理、操作方法以及应用。
一、PCR技术的原理PCR技术的核心是DNA扩增，扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应具体流程如下：1. 变性：将DNA分子的双链分离成单链，这是PCR反应最重要的一步，因为只有在单链DNA的状态下，才可以实现DNA扩增。
变性时，将样品加热至95℃左右，使DNA分子双链断裂，形成单链状态。
2. 退火：将引物与模板DNA配对结合。
在引物含量过高的情况下，引物与DNA模板发生杂交，此时引物为20个碱基左右的短链DNA。
3. 延伸：在真核生物中，PCR反应中含有酶——聚合酶，它是从热温泉海洋微生物中提取的。
模板的DNA片段会在此时开始合成，固定引物会拓展其3’端，引物和模板组成的DNA模板将聚合物质合成DNA分子。
以上流程反复反应，就可快速扩增出含有想要的DNA碱基序列的DNA分子。
其中，引物的设计相当关键，因为只有用恰当的引物才能选择性地扩增出目标片段。
二、PCR技术的操作方法PCR反应仪是PCR技术的关键设备，这种设备非常专业，主要用于DNA扩增，一般比较昂贵，属于生物化学实验室的常备设备。
下面我将简单介绍PCR技术的操作步骤：1. 选择DNA模板：DNA模板通常来自于细胞、组织、疾病病源体等。
需要注意的是，DNA模板存在于原始样本细胞中，如果样品纯度不够高，浓度也不够，就不能很好地进行PCR反应，因此提取出DNA模板非常重要。
2. 设计引物：引物在PCR反应过程中发挥重要的作用，选择与预期扩增DNA片段保持完美匹配的引物非常关键。
引物设计时需要考虑引物长度、熔点、GC含量、引物特定性、杂交温度等因素，设计优秀的引物有助于提高PCR反应的特异性和灵敏度。
聚合酶链式反应技术的基本原理
聚合酶链式反应技术的基本原理在现代生物技术领域，聚合酶链式反应技术（PCR技术）被广泛应用于DNA分析、基因克隆、遗传疾病诊断等领域，成为分子生物学研究中不可或缺的工具。
PCR技术的基本原理是通过体外合成DNA的方法，在恶劣条件下模拟细胞内DNA复制的过程，从而对目标DNA进行扩增。
PCR技术包括三个基本步骤：变性、退火、延伸。
首先，将混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋变性，形成两条单链。
接着通过将温度降至50-65摄氏度，引导引物（两条DNA链的引导序列）与单链DNA结合，实现引物的互补结合。
最后在72摄氏度下，DNA聚合酶沿着引物以双链DNA为模板逐渐延伸合成新的DNA链。
这一循环的过程使得目标DNA得以指数级扩增。
PCR技术的成功需要高效的DNA聚合酶、特异性的引物设计以及适当的温度控制。
在实验室操作中，研究人员需要根据不同的DNA片段长度、GC含量等因素设计引物，确保引物与目标DNA特异性结合，避免产生假阳性结果。
此外，温度梯度PCR技术的出现使得在一次PCR反应中同时扩增多个DNA片段成为可能，提高了PCR技术的多样性和灵活性。
PCR技术的应用广泛，不仅可以在科研领域用于DNA序列分析、基因克隆、突变检测等，还被广泛应用于医学诊断、法医学鉴定、遗传学研究等领域。
例如，在疾病诊断中，PCR技术可以快速、准确地检测出病原体的DNA片段，帮助医生做出诊断和治疗决策。
总的来说，PCR技术作为一种高效、敏感、特异的DNA扩增技术，在生物学和医学领域发挥着重要的作用。
随着技术的不断改进和发展，PCR技术将继续在基础研究和应用领域发挥重要作用，推动生命科学领域的进步和发展。
1。
PCR
PCR自测题一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
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在PCR的退火期，探针与引物所包含序列 内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到 达探针处，Taq酶发挥5‘→3’外切核酸酶活 性，继而发生置换，切断探针后，发射基 团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增 加。模板每复制一次，就有一个探针被切 断，伴有一个荧光信号的释放。
• Mullis 1993• 年度诺贝尔化学奖。 • PCR技术是一种利用DNA变性和复性原 理在体外进行特定的DNA片段高效扩增 的技术，可检出微量靶序列（1个 copy）。在模板DNA、引物和dNTP存 在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合 成反应。 • 仅需用极少量模板，在一对引物介导下， 在数小时内可扩增至100-200万copy.
• 标准的PCR反应体系：
•
10×Buffer 10ul dNTP mixture per 200umol/L primers per 10～100pmol templete DNA 0.1～2ug DNA polymerase 2.5ul Mg2+ 1.5mmol/L dH2O 100ul
• PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
由于被释放的荧光基团数目和PCR产物 数量是一对一的关系，且光密度同释放的 荧光基团的数目也成正比关系，因此该技 术可对模板准确定量。由于扩增产物短时 效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。
植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统 进化
畜 牧
畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、 牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺 陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼
植物保护
• 引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互增
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
PCR反应分三步：变性、退火及延伸。
• PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。 • ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备； • ②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； • ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。
作用原理
• 实时荧光定量PCR常用的检测模式： • （1）TaqMan探针 • （2）SYBR GreenⅠ
TaqMan探针方法的作用原理:
原理：利用Taq 酶的5‘→3’外切核酸酶活性 并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记 探针。 TaqMan探针5‘端标以荧光发射基团，3’ 端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中 不能被延伸。当探针保持完整时，3‘端猝灭 基团抑制5’发射基团的荧光发射。
PCR 应用 遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症
传染性疾病
肝炎 性病 肿瘤
法医学
个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。• 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。
聚合酶链反应技术（PCR）
2009.8
• PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能 在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分
其他
①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学
实时定量PCR
Real-time Quantity PCR
• 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起 来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技 术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板 的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠 性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 无污染性、具实时性和准确性等特点 。