通过测定血浆和尿液中的肌酸和胍基乙酸来诊断肌酸代谢疾病

通过测定血浆和尿液中的肌酸和胍基乙酸来诊断肌酸代谢疾病Qin Sun和William E. O’Brien摘要肌酸代谢疾病包括肌酸运载体缺乏，还有参与肌酸合成的精氨酸-甘氨酸脒基转移酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶（GAMT）这两种酶的缺乏。

实验室对这些疾病的诊断依赖于血浆和尿液中肌酸和胍乙酸的测定。

这里我们记述一种快速HPLC/MS/MS法，测量将分析物衍生化后经正相HILIC分离后的产物。

关键词：肌酸，胍基乙酸，精氨酸-甘氨酸脒基转移酶，AGA T，胍基乙酸甲基转移酶，GAMT，肌酸运载体，质谱分析法1.引言肌酸和磷酸肌酸对于细胞内ATP能量池的时空调控至关重要（1-3）。

人类从膳食来源和内源获得肌酸，后者通过精氨酸-甘氨酸脒基转移酶（AGAT）和胍乙酸甲基转移酶这两种酶参与的较短的两步法合成通路，提供高达50%的日常肌酸要求。

在第一步中，精氨酸-甘氨酸脒基转移酶催化从甘氨酸和精氨酸合成鸟氨酸和胍基乙酸（GAA）。

然后胍乙酸甲基转移酶把GAA转化成肌酸，此步反应需要s-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，而且是最大的SAM消耗反应。

大部分肌酸合成发生在肾脏，然后由肌酸膜运载体接受（CRT）（4）这些疾病涉及到肌酸合成和膜上肌酸运载体两者（5-10）。

这些病都是罕见的，至今只有两例AGAT缺乏；一百多例GAMT缺乏和几例CRTR缺乏，但是很可能随着对这些病了解的增多，将发现更多的病例。

婴儿期和童年期的病人表现为发育迟缓，肌张力减退，也出现过几例癫痫。

对于GAMT缺乏的病人，在婴儿期肌酸处于低水平到正常限值内，但是如果先证者实行严格的素食，在青春期肌酸会下降。

高血浆GAA浓度被认为能确诊GAMT缺乏。

这些病人脑部的磁共振检查显示肌酸缺乏和磷酸胍乙酸累积（11）。

对于AGAT缺乏，生物化学检测显示血浆中肌酸和肌酐量极低，GAA的浓度也低。

通过测量羊水中的胍乙酸，产前诊断是可能的（12）。

肌酸运载体，在给脑、骨骼和心肌提供充足能量上起到重要作用，对肾脏再吸收肌酸也至关重要，也负责GAA的大脑分佈和摄取（13,14）。

运载体由X染色体上的一个基因（SLC6A8）编码。

这个基因的突变也在X相关智力迟钝的病人中发现（6, 7, 15–17）。

生物化学变化在初发病例中表现为尿肌酸/肌酐的比值升高。

有趣的是，在一碳甲基代谢被妨碍的紊乱中也报告了胍乙酸和/或肌酸排泄变化，例如，在s-腺苷甲硫氨酸水解酶缺乏和钴胺素缺乏的情况下（18,19）。

对乙酸和肌酸测定已报道过数种方法，如使用HPLC, GC/MS,和HPLC/串联MS（20-23）技术的方法。

虽然用这些方法定量尿液中高浓度的胍乙酸和肌酸没有困难，但是难于准确测量AGAT缺乏时出现的低血浆胍乙酸浓度不够灵敏。

我们描述了一种改良的串联MS方案，使用衍生分析和亲水交互作用柱（HILIC）。

HILIC是正相色谱分析法的变体，用于分离非常极性的物质。

这个方法足够灵敏，能测量低浓度的胍乙酸并能同时分析尿液和血浆的样品。

2.材料标本要求1.血浆样品（肝素钠抗凝）：立即离心样品并把血浆（0.5–1.0 mL）转移到标记的试管中。

在-16℃或以下冷冻储存。

样品应该在收集后的两周内分析。

样品在收集地点和实验室之间的运输应该有干冰（见备注1）。

2.尿液样品：冷冻2–5 ml尿液。

标本可以冷冻储存2周。

样品在收集地点和实验室之间的运输应该有干冰（见备注1）。

试剂1.1%甲酸铵：在800ml HPLC级H2O中添加10ml甲酸，用浓氢氧化铵溶液调整pH到4.0，使总体积达到1升。

在室温储存。

可稳定2年。

2.HPLC运行缓冲液：包含0.05%甲酸铵的95%乙腈。

在950ml乙腈中添加50ml 1%的甲酸铵溶液。

在室温储存，可稳定2年。

3.衍生剂，配制在正丁醇中的3N盐酸（Regis Technologies, Inc., Morton Grove, IL）标准品和校准品1.肌酸标准品一级储存液，6 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中中添加44.75 mg肌酸。

可冷冻（-16℃或以下）储存达2年。

2.肌酸标准品次级储存液，600 μM：用9 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）稀释1ml肌酸标准品一级储存液，使有效浓度为600 μM。

冷冻储存可达1年（-16℃或以下）。

3.肌酸质量控制溶液，7.6 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加50 mg肌酸。

4.胍基乙酸标准品一级储存液，5 mM：在50 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）添加29.3 mg胍基乙酸。

冷冻储存储备溶液可达2年（-16℃或以下）。

5.胍基乙酸标准品次级储存液，50 μM：把100μl储备溶液与9.9 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）混合稀释。

冷冻储存可达1年（-16℃或以下）。

6.胍基乙酸质量控制溶液，850μM：在250ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加25mg GAA。

7.按如下步骤制备肌酸和胍基乙酸标准品的工作液（见备注1）：a.GAMT A标准液，300μM肌酸和25μM GAA ：混合等体积的600μM肌酸和50μM胍乙酸的次级标准品储存液。

b.GAMT B标准液，30μM肌酸和2.5μM GAA：以1:10的比例混合上述GAMT A标准液和95%乙腈。

8.根据1制备6个校准品，在充分混合后用SpeedVac干燥。

干燥时间大约是30分钟。

表1内标和质控品1.内标（D3-肌酸）：在20 ml乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50）中添加10mg D3-肌酸，使溶液浓度大约为3.7 mM，本储备溶液在-16℃或以下冷冻储存可稳定5年。

按1/500混合储备溶液与乙腈与水的混合液（乙腈/水=50/50），配制成内标工作液（大约 6.35 mM）。

在-16℃或以下可储存1年。

2.尿液对照：可以使用志愿者或者无药物尿的混合尿液。

按照1:10用水稀释混合尿液，制备“正常的”尿液对照。

使用未稀释的尿液作为“高值”控制品。

将上市对照液分装，在-16℃或以下冷冻储存。

3.血浆对照：使用新鲜的冷冻血浆或相似材料制备对照品。

其一部分进行分装来制备“正常的”对照。

在4ml新鲜冷冻血浆中添加100μl 7.6mM肌酸和100μl 850μM胍基乙酸质量的控制标准液，制备“高值”控制品。

设备1. Micromass Quattro Micro Spectrometer (Waters Corp., Milford, MA)2. Waters 2695 HPLC (Waters Corp., Milford, MA).3. Atlantis HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) HPLC column, 2.1×100mm, 5 μm (Waters Corp. Milford, MA).4. Masslynx analytical software (Waters Corp., Milford, MA).5. SPD1010 SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, A).3.方法血浆样品制备1.解冻样品，混合均匀。

样品处理可在室温下进行。

2.向适当标记的1.5ml 微离心管中转移30μl 血浆样品和添加10μl内标工作溶液。

3.在以上的混合物中添加300μl乙腈，涡旋振荡使蛋白质沉淀。

4.在桌面离心机中以10,500×g的速度离心10分钟。

5.把上清液转移到一个新的标记试管，在SpeedVac中彻底干燥液体（在45℃加热45分钟）。

尿液样品制备1.测定尿液样品的肌酐浓度。

肌酐值用于在随后的步骤中调整适当的尿液稀释度。

本检测不适用于肌酐浓度小于0.1 mg/ml的样品（见备注2）。

2.如果肌酐浓度在0.1-0.4 mg/ml之间，用去离子水按照1:10稀释样品，如果肌酐的浓度在0.4 mg/ml以上，则以1:75的倍数稀释样品（见备注3）。

3.用去离子水按照1:10稀释正常和高值尿液对照品。

4.把10μl稀释的尿液样品和对照品转移到1.5ml的标记微的离心管中。

添加10μl内标工作溶液，涡旋混合。

5.在45℃下用SpeedV ac彻底干燥加热45分钟。

微量液体不影响最终结果。

HPLC/ MS/MS分析的样品制备1.干燥后向所有试管中各添加70 μl 3 N HCl的正丁醇溶液，包括标准液、对照品和样品，混合均匀。

2.把试管放在65℃加热块中20分钟，在此期间至少涡旋一次。

3.取出试管，在45℃的SpeedVac中干燥内容物。

干燥时间大约为30分钟。

微量液体不会影响最终结果。

4.在每个试管中添加1ml 95%乙腈，混合均匀。

5.在10,500×g下离心试管6分钟，以除去任何悬浮微粒。

6.把150μl上清液转移到150μl样品瓶中，供色谱分析。

HPLC和串联质谱分析法的设置（见备注4）1.亲水CRT和GAA的色谱分离在室温下执行，使用Atlantis HILIC（亲水作用色谱）HPLC柱，2.1×100 mm, 5 μm。

流动相的流速保持在0.2 mL/min。

2.质谱分析仪的设置如下：电喷射阳离子模式（ESI+），毛细管电压3.5 kV，源锥孔电压25 V，提取电压4V，源温度130℃，脱溶剂温度350℃，分析仪碰撞15。

喷雾器和去溶化的氮气速率分别是90和600 l/h。

3.采用多反应监测（MRM）：胍乙酸174>101，肌酸188>90，D3-肌酸191>93。

典型色谱图见图1。

图1：样品的LC-MS/MS分析色谱图。

各个MRM检测离子对如下：上图，D3-肌酸（m/z191>93）；中图，在6.3分钟肌酸（m/z 188>90）；下图，在6.0分钟GAA （m/z 174>101）。

数据分析1.使用Masslynx软件，从标准曲线计算出样品和质控品的浓度。

表2的浓度值考虑到检测中使用的样品体积。

需要输入尿液稀释因子，供Masslynx计算数值。

只要样品体积不变，不需要进一步计算。

2.标准曲线的相关系数（r2）应该在0.97.3以上。

3.对照值应该在既定对照均值±2 SD之内结果方可接受。

质控范围的例子见表3和.4。

表2肌酐mg/ml H2O稀释分析的尿样体积（μL）分析的标准样品体积（μL）由于体积差异进行的额外稀释最终稀释因子0.1–0.4 10 10 30 3 30 (10×3) 0.4及以上75 10 30 3 225 (75×3)表3表4血浆质控范围例4. 如果临床样品的数值高于标准曲线的上限，那么必须进一步稀释和重新分析。