多管发酵法测定水体中大肠杆菌
水中大肠杆菌的检测方法
附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法NIEA E201.54B一、方法概要本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ±1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。
二、适用范围本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。
三、干扰(一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。
(二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。
四、设备(一) 量筒：100至1000 mL之量筒。
(二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。
(三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。
(五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。
(六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。
(七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。
(八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。
(九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。
(十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
(十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。
(十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。
实验十一 多管发酵法测定水中大肠菌群PPT教学课件
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Байду номын сангаас
三、实验材料
1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍
浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套 管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪器或其他用具：
载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭 菌试管等。
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四、操作步骤
1．水样的采取 实验室提供水样 2．河水的检查 （1）初（步）发酵实验
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二、实验原理
发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法
1) 初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳
糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经 37 ºC培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内 加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后， 培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判 断是否有大肠菌群存在。
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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引 起糖类发酵，因此需要进一步证实。
将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美 兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带 核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可 能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进 一步证实是否为大肠菌群。
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图1 2020/12/10 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释 11
PPT教学课件
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水样的稀释： 10-1与10-2
实验三 多管发酵法检测水中的大肠菌群
实验三多管发酵法检测水中的大肠菌群（一）实验目的1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义2．学习检测水中大肠菌群的方法（二）实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1．初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2．平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。
3．复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
（二）实验器材1.水样自来水2．试剂乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。
3．仪器及其它用品载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。
（四）实验方法1．水样的采取水源水2．初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml 三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。
饮用水大肠杆菌测试
多管发酵法测大肠杆菌群一、实验目的1、学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）2、了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性二、实验原理我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：1、细菌总数1ml水中不超过100个。
2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。
3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。
多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
三、适用范围：大肠菌群系指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
通常用此法作为粪便污染指标来评价食品以及饮用水的卫生质量。
四、检验程序：→→→→→→五、操作方法：5.1 以无菌操作，将检样10ml被测液放于含有90ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
5.2 用1ml 灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均（均液的PH值应在6.5～７.5之间，必要时分别用1mol/L 匀，做成1：100的稀释液。
氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL）调节。
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群
多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。
在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。
笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。
关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。
在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。
不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。
按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。
而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。
初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。
经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。
在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。
1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断：分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。
多管发酵法测定水中大肠菌群
综合实验报告书（2014~2015 学年）实验题目多管发酵法总测定水中大肠菌群学院名称生物与食品工程学院专业（班级）2012级生物工程姓名（学号）孙大林20122151032015年01 月13日多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：利用多管发酵法检测自来水和池塘水中大肠菌群的数量，以对不同水样的大肠菌群污染情况做出初步判断。
根据«中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验法»中有关大肠菌群的检测方法与指标对上述水样进行检测。
通过记录阳性管数并查最大可能数表（MPN）查出不同水样中大肠菌群的可能含量。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验，得出水样中总大肠菌群数，实验结果以最大可能数MPN表示。
关键词：多管发酵法、大肠菌群、最大可能数（MPN）Abstract: the use of multiple tube fermentation test of tap water and the number of coliform group, pond water in different water samples of coliform bacteria pollution make a preliminary judgment.According to "the People's Republic of China national drinking water standard inspection » in the fecal coliform detection method and index of the water samples fortesting.Tube by a positive record number (MPN) maximum possible log tables and check of coliform bacteria may content in different water samples.Multi-tube fermentation principle is based on fecal coliform bacteria can ferment lactose produce acid gas and possess a gram negative, no spore, assumes the rods and so on characteristics, through the early (step) fermentation test, plate separation and the complex fermentation test three steps of the experiment, it is concluded that the total number of coliform bacteria in water samples, the experimental results with the greatest possible number of MPN said.Key words: multi-tube fermentation coliform groupthe greatest possible number (MPN)由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
游泳池水中大肠菌群检验方法
游泳池水中大肠菌群检验方法一、大肠菌群多管发酵法测定1定义大肠菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2 仪器见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。
3培养基和试剂3.1乳糖蛋白胨培养液3.1.1成分：蛋白胨 10g牛肉膏 2g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。
再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。
3.2伊红美兰琼脂见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.3革兰氏染色液风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.4染色法见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
4推测性试验4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。
4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。
4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。
4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。
5证实试验5.1平板分离自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
5.2复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。
5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
多管发酵法测自来水大肠菌群
综合实验：多管发酵法测自来水大肠菌群组员：李妍、马万贵、石真真、李招柳、池小辉一、实验目的1、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系；2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;3、培养学生自主设计并完成实验的能力，激发学生的科研主动性与积极性；4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。
二、实验原理大肠菌群——能在37 ℃24-48h内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，易于培养和观察。
粪便中存在大量的大肠菌群细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性。
水中病原菌浓度很低，测定手续复杂，工作人员还有被感染传播的危险。
所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测大肠菌群。
多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵3个部分。
初发酵中发酵乳糖产酸、产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性(液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。
由于许多细菌不能发酵乳糖，不生长，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）乳糖起选择性碳源的作用。
溴甲酚紫是PH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点PH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的PH由中性下降呈酸性，培养基从紫色变为黄色。
另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌（如芽孢杆菌）生长的作用)。
平板分离一般利用大肠菌群在伊红美蓝（EMB培养基）上形成紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断（作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核的、有金属光泽的深紫色菌落。
将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落）。
最后进行复发酵进一步证实。
三、实验材料及用具1、培养基：伊红美蓝培养基（EMB培养基）、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白培养液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水3、仪器及用具：三角瓶（2个）、发酵用试管（32个）、发酵用烧瓶（4个）、杜氏小管（36个）、培养皿（12个）、移液管、接种环、酒精灯、记号笔、油镜四、操作步骤（一）水样的采取1、自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
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每100ml水样中总大肠菌群数近似数
3.3.3平皿培养基的配制
将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液，加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。
多管发酵法测定水中大肠菌群实验报告
多管发酵法测定水中大肠菌群摘要：初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不的为阴性反应。
平板分离实验中把初实验产期产酸的试管的菌接到伊红美兰琼脂平板上然后培养24小时。
复发酵实验中将以上大肠杆菌阳性菌落，经涂色染色为革兰阴性无芽孢杆菌，通过次试验进一步证实原理：初发酵实验：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一个杜氏小管。
乳糖能其选着作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠杆菌能发酵乳糖而产气产酸。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为指示剂，细菌产酸后培养基由原来的紫色变为黄色。
初步发酵实验中将水样接种与乳糖蛋白胨液体培养基的发酵管内，37度下培养，24内小管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性如果，如果出现产生气泡但不变色或者变色但不产气的情况，应该延长培养至48小时，若仍不产气的为阴性结果。
平板分离：伊红美兰琼脂培养基有伊红和美兰两种染料，在此作为指示剂，大肠杆菌发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料及结合，使培养基产生有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵实验：以上大肠杆菌阴性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢的，通过此试验进一步证实。
原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠杆菌阴性结果。
材料与用具：1.培养基乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置杜氏小管）三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有杜氏小管）伊红美兰琼脂平板2．无菌水3. 用具载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌试管灭菌吸管方法：1水样的采取从不同水体（自来水、河水）中采集样品2自来水检查（1）初发酵实验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。
在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。
多管发酵法检测水中大肠菌群数量
利用多管发酵法检测水中大肠菌群数量作者：摘要：本实验利用多管法检测水中大肠菌群数量，以反映城市供水是否符合标准。
关键词：多管发酵法大肠杆菌最大可能数(MPN) 发酵试验平板分离前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严格的常规监测。
但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。
因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。
大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。
因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。
1．原理：多管发酵法是根据大肠杆菌群细菌能发酵乳糖产酸产气及具备革兰氏染色阳性、无芽孢呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行实验，以求得水样中的总大肠菌群数，最大可能数（MPN）来表示实验结果。
2．实验2．1实验材料2．1．1 实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。
2．1．2 培养基：乳糖蛋白胨培养基（分装于10支试管中，内涵倒置杜氏小管）、3倍浓度乳糖蛋白胨培养基（分装于5支试管中，内涵倒置杜氏小管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。
（培养基均为灭过菌的）2．1．3染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。
2．1．4水样：拧开龙头流水5分钟后取自来水。
2．1．5其他：灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。
2．2 实验步骤2．2．1初发酵试验：a 取5支装有3倍浓度乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积10ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积1ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积0.1ml。
b 用灭菌移液管分别吸取10ml水样加入到标记号的3倍浓度培养基试管中；分别吸取1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中；分别吸取0.1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中。
水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)
水中大肠杆菌群书的检测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的检测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、实验器材：1. 水样：自来水2.试剂：乳糖蛋白胨发酵管内有倒置小套管三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管瓶内有倒置小套管伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板革兰氏染液。
3.仪器及其它用品：载玻片灭菌带玻璃塞空瓶灭菌吸管灭菌试管革兰氏染液显微镜香柏油二甲苯擦镜纸吸水纸灭菌三角瓶等四、实验步骤：第一步：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二步：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三步：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四步：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查表，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）.。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。
2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
本标准参照GB 5750-85制订。
3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。
3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。
3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。
再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。
水中总大肠菌群的测定
水中总大肠菌群的测定－多管发酵法一、实验目的结合水净化工程中的细菌检验，掌握水环境监测中和给水水质检验中大肠杆菌群数的测定方法，同时通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性。
二、原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
三、仪器高压蒸气灭菌器；恒温培养箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接种棒；培养皿（直径100mm）；试管（18×180mm）；吸管（1、5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。
四、培养基的制备：1.乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。
3.品红亚硫酸钠培养基（1）贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入 3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH至7.2—7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250 或500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液（1000mL培养基约加20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠（1000mL 培养基约加5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。
微生物综合实验报告——利用多管发酵法检测水中大肠杆菌群数量
微生物综合实验报告实验题目：水质微生物学分析——利用多管发酵法检测水中大肠杆菌群数量组员姓名：xxx作者单位：南京工业大学生物与制药工程学院专业班级：生物工程类1001班指导老师：xxx摘要：实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。
通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。
关键词：水源；肠杆菌；数量；污染前言：水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。
水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次产品。
另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分。
近年来，由于国际上一些地区和国家频繁发生恶性事件，饮用水安全和卫生问题引起了全球的关注，饮水安全已经成为全球性的重大战略性问题。
世界卫生组织调查表明：在发展中国家，各类疾病有8%是因为饮用了不安全、不卫生的水而传播的，每年大约有2000万人死于饮用不卫生的水。
必须严格控制水的微生物学质量，以保证医药食品产品、培养基、试剂等的质量的可靠性以及人类饮用水的安全。
我国饮用水水质微生物学指标：国际上目前主要的水质标准是世界卫生组织（WHO）制定颁发的《饮用水水质准则》制药用水微生物监测是为了监控控制性微生物从而将水中微生物含量维持在一定水平。
没有必要将水中存在的所有微生物都监测出来，只针对对产品对人具有潜在危害的致病性的微生物进行监控。
流行病学研究确认，水携带的病原菌的存在与肠道来源的细菌相关，肠道病原微生物进入水体，随水流传播可引起肠道病爆发流行，所以必须对水中病原微生物严格监控。
但要从水体中直接检出病原微生物比较困难，它们在水中的数量很少且培养条件苛刻，分离和鉴别都比较难，即使样品检测结果是阴性也不能保证没有病原微生物的存在。
因此，常用指示微生物作为水体中病原微生物的监测指标。
大肠菌群细菌在人的肠道和粪便中数量很多，受到粪便污染的水容易被检出，且检测方法比较简易。
实验十一_多管发酵法测定水中大肠菌群
图1 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释
3） 复发酵试验(完成实验） 复发酵试验(完成实验）
将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入 1倍乳糖培养液中，经37 ºC培养24 h，产酸产 培养24 h， 倍乳糖培养液中， 气者即最后确证为存在大肠菌群。 气者即最后确证为存在大肠菌群。 产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、 产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、 产气则记为阴性反应； 产气则记为阴性反应； 根据阳性管数量， 根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群 的数量。 的数量。
三、实验材料
1、培养基： 培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍 ）， 浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套 浓缩乳糖蛋白胨发酵管（ ）（内有倒置小套 管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 ），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 伊红美蓝琼脂平板 2、仪器或其他用具： 仪器或其他用具： 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管， 菌试管等。 菌试管等。
（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复 初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管 初步发酵试验。 查表1 即得大肠菌群数。 查表1，即得大肠菌群数。
10ml×100 × 3× × 1支 支
× 1ml×100 1ml×10-1 1ml×10-2 × × 1× × 1× × 1× × 各3支 支
2）平皿分离（证实试验） 平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引 水中除大肠菌群外， 起糖类发酵，因此需要进一步证实。 起糖类发酵，因此需要进一步证实。 将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美 兰培养基， 培养24 h，根据菌落特征， 兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征，挑 取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色， 取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色， 进一步证实是否为大肠菌群。 进一步证实是否为大肠菌群。
实验九多管发酵法测定水中大肠菌群
证实有大肠菌群存在后，再根据复发酵的阳性管
（瓶）数查表，即得每升水样中的大肠菌群数。
▲ 将100、10、1、0.1（10-1）ml水样的发酵管 结果查水 样的发酵管结果查表4
五 实验报告
实验课程论文
封面格式 《水处理微生物学》课程实验
水样管/ml 100 10 1 0.1 0.01
发酵结果
2 思考题
(1) 大肠菌群的定义是什么? (2) EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查 大肠菌群时，各起什么作用？
存在于肠道中的正常菌群,在正常生理情 况下不致病.
（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli） E.coli
（2）产气杆菌（Aerobacter aerogenes） （3）枸橼酸盐杆菌（Coli citrovorum） （4）副大肠杆菌（Paracoli） 大肠菌群的生理习性与病原菌相似，并且外界 存活时间基本一致.
经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢 杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通 浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一 初发酵管的同类型菌落1--3个，37℃培养24h，结果 若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
同类型菌落① 深紫黑色、有金属光泽。 ② 紫黑色、不带或略带金属光泽。 ③ 淡紫红色、中心颜色较深。
3 复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片革兰氏染 色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再 进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸 又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
水样 接种
初步 发酵
产酸 产气
大肠菌群
厌氧芽孢杆菌
好氧芽孢杆菌
平 板 分 离
鉴 别 培 养 基
产酸 复发酵
实验二 多管发酵法测定水中大肠菌群总数
实验二多管发酵法测定水中大肠菌群总数一．实验目的和要求1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。
2．巩固细菌学检验法的内容。
二．原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
三．仪器(1)高压蒸气灭菌器。
(2)恒温培养箱、冰箱。
(3)生物显微镜、载玻片。
(4)酒精灯、镍铬丝接种棒。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。
四．测定步骤1．生活饮用水：①初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。
在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。
②复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。
2．水源水①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1∶10稀释的水样。
多管发酵法测定水中大肠菌群
多管发酵法测定水中大肠菌群
第1页
多管发酵法测定水中大肠菌群
一、试验目标 二、试验原理 三、试验材料 四、试验步骤 五、试验汇报
多管发酵法测定水中大肠菌群
第2页
一、试验目标
1、学习测定水中大肠菌群数量多管发酵法。 2、了解大肠菌群数量在饮水中主要性。
多管发酵法测定水中大肠菌群
划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养 18～24 h，将符合以下特征菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第9页
（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌菌株重复初
步发酵试验。并依据初发酵管试验阳性管查表， 即得大肠菌群数。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第4页
2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，还有其它细菌可能引 发糖类发酵，所以需要深入证实。
将初发酵管中已发酵菌液接种于伊红美兰 培养基，37 ºC培养24 h，依据菌落特征（带关 键、有金属光泽深紫色菌落），挑取可能为大 肠菌群菌落制片，经革兰氏染色，深入证实是 否为大肠菌群。
水样稀释： 10-1与10-2
接种：分别吸收1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装 有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原 水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ， 混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气继续培养48 h。
多管发酵法测定水中大肠菌群
第8页
（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气发酵管，分别
2.思索题
（1） 何谓大肠菌群，它主要包含哪些细菌属？
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多管发酵法测定水体中大肠杆菌
姓名：马文霞学号：320100922240
学院：生命科学学院班级：2010生态班
实验时间：2011年11月9日地点：贺兰堂C104
摘要：生活用水水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染，因此必须对生活用水及其水源水进行严格的细菌学检测。
因为病菌数量少，要从自来水中分离出病原菌非常困难，这样就要找一个合适的指示菌，最广泛应用的指示菌是大肠菌群，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
根据水体中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，检测大肠菌群的方法有多管发酵法、滤膜法。
关键字：灭菌、划线、接种、镜检
引言：学习检测水中大肠菌群的方法
了解大肠菌群数量与水质状况的关系
材料与器材：
培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。
仪器：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。
方法：
1、水样的采集
自来水将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水
5min，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，
以供检测。
池水、河水或湖水将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm 深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。
2、初（步）发酵实验
将水样分别接入10支装有10ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，37℃培养48h。
3、平板分离
将经24h和48h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃培养18～24h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。
深紫黑色，有金属光泽；
紫黑色，不带或略带金属光泽；
淡紫红色，中心颜色较深。
4、复发酵试验
经涂片、革兰氏染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管同类型菌落1－3个，37℃培养24h,结果或产酸又产气，即证实又大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管数查表
XV-2(P186),即得大肠菌群数。
结果：
10ml水样的阳性管数为三支，查表得每升水样中的大肠菌群数为11. 讨论：
1.进行涂片时的菌落和重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发
酵管中菌落必须是同一菌落。
2.进行复发酵实验是为了排除杂菌干扰实验结果的可能性。
参考文献：
沈萍、范秀荣、李广武《微生物学实验》高等教育出版社，北京，1999 张琪、白璐、陈勇《微生物学讲义》。