玉米晚报叶斑病菌的荧光标记(GFP和DsRed)

phosphoribosyltransferase, mRNA
2.1
G4
1125
157
86%
源自文库
Sclerotinia sclerotiorum 1980 hypothetical XM_00159491
编号 病情
59.6 52.3 30.5 10.7 59.4 53.4 58.2 33.5 56.7 0 指数
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❖转化子插入位点分析
侧翼序列基因的比对
转化子 长度 Max Max (bp) score ident
基因注释
登录序列号
R1
627
102
70%
Pyrenophora teres f. teres 0-1 hypothetical protein, mRNA
菌黑暗条件共培养48h，共培养介质以微孔滤膜时转化效果
最佳，转化效率可达到100-110个转化子/106个孢子。
筛选用CM培养基所得到的转化子全为阳性，而 以PDA为筛选培养基得到部分为假阳性；共培养时光照无 影响。
转化子筛选菌落
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单孢分离
❖转化子荧光观察
gfp标记的新月弯孢
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DsRed标记的新月弯孢
❖转化子分子检测
M G1 G2 G3 G4 GFP R1 R2 R3 R4 DsRed Cl hyg
gfp
荧光标记的新月弯孢菌株中hyg基因、gfp基因 和DsRed基因的PCR检测
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DsRed
Southern 杂 交 结 果 显 示 ，
Cl G1 G2 G3 G4 R1 R2 R3 R4
玉米弯孢叶斑病菌的荧光标记 及其在玉米侵染过程研究
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报 告 人 ：陈茂功
指导老师：周印富 教 授
研究员
王晓鸣
教授
林小虎
汇报内容
1
研究背景
2 农杆菌介导的新月弯孢转化
3
转化子插入突变分析
4 新月弯孢对玉米侵染过程
5 玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选
6
全文结论
7
致谢
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一.研究背景 ❖玉米弯孢叶斑病发生与危害
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❖本文研究目的及意义
目前对该病害研究主要集中在抗病品种与病菌 变异和致病机理等方面，但对该病菌在玉米叶片上的侵 染及发育过程仍不十分清楚。
运用荧光蛋白（绿色和红色）标记新月弯 孢，通过生理生化等指标的筛选得到与野生菌相近的转 化子，利用转化子观察新月弯孢在玉米叶部的侵染过程 ，分析新月弯孢在抗感玉米中侵染过程的差异。
大多数转化子为T-DNA单 kb 拷 贝 插 入 ， 且 Southern 23.0— 杂交条带所处的位置各 9.4 — 不相同，这说明T-DNA在 4.6— 基因组中的插入位点不 2.3— 同，没有明显的位点插 入偏好。
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❖转化子稳定性分析
转代四次后
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三.转化子插入突变分析 ❖转化子的生长特性
果胶酶
❖转化子的粗毒素、致病力
Cl R1 R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4
转化子发酵液体培养基的滤液
Cl
R1
R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4 CK
离体叶片针刺粗毒素后的病斑症状
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转化子粗毒素产生的离体叶片病斑面积
转化子接种5 d后寄主的病情指数
菌株 Cl R1 R2 R3 R4 G1 G2 G3 G4 CK
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❖技术路线
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二.农杆菌介导的新月弯孢转化 ❖筛选抗生素的确定
0
50
100
150
200
头孢噻肟钠对农杆菌抑菌浓度的测定
0
30
50
75
100
150
潮霉素B对分生孢子萌发抑制浓度的测定
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❖农杆菌介导转化因素的优化
共培养介质
受体材料
孢子萌发时间
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共培养温度和时间
当弯孢病菌分生孢子萌发12h后，在25℃与农杆
XM_00329594 8.1
R2
790
482 77%
Pyrenophora tritici-repentis Pt-BFP ATP XM_00193327
phosphoribosyltransferase
4.1
G1
522
231 81%
Paracoccidioides brasiliensis Pb01 ATP XM_00278895
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农杆菌T-DNA转化真菌机制示意图
❖荧光蛋白在植病中的应用
用于病原菌在植株中侵染 途径的研究
用于植物病原菌及生防菌 在植物根部的定殖研究
作为报告基因用于抗病转 基因植株的筛选
用于病原菌致病基因表达 活力的研究
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普通显微镜观察 荧光显微镜观察
❖玉米弯孢叶斑病抗性研究
抗性资源筛选方法：孢子悬浮液高压喷雾接种
玉米弯孢叶斑病（Curvularia leaf spot） ，又称黑霉病、拟眼斑病，在我国主要是由新月弯孢（
Curvularia lunata（Wakker）Boed.）引起，是继玉米
大斑病、小斑病后又一主要叶部病害。
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在我国，上世纪70年代起偶有发生。至80年代，随着 气候变化和栽培制度变更，该病害逐步开始流行，相继蔓 延到我国辽宁、北京、河北、河南、陕西、山东、吉林和 天津等十余个省市。
叶片
叶鞘
茎
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苞叶
弯孢叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶 部病斑密集成片，病株率及病叶率高达100%。一般玉米减 产20%～30%，严重时减产50%以上， 甚至绝收。
精品课件 北京昌平严重弯孢菌叶斑病品种
❖农杆菌介导的遗传转化
目前农杆菌介导的遗传转化已经成功用于多种真菌的遗 传转化，其中包括子囊菌纲（48个种）、担子菌纲（8个 种）、接合菌纲（4个种）和卵菌纲（3个种）。尤其那些传 统方法很难转化的，如长蠕孢霉、双孢蘑菇、玉米大斑病菌、 玉米弯孢叶斑病菌等。
待玉米四叶期时，以接种液（Tween20：0.02%；无菌水） 调节分生孢子浓度至1.0×106个/mL，用高压喷雾的方法接种于叶片。
病级评价标准：
1级—叶片上无病斑或病斑面积≧5%； 3级—少量病斑（6~10%）； 5级—叶片上病斑较多，占叶面积（11%~30%）； 7级—叶片上有大量病斑，病斑相连，占叶面积 （31%~70%）； 9级—叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；
R1
R2
R3
R4
G1
G2
G3
G4
Cl
转化子在CM培养基的菌落形态
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A pH4.0
B pH5.5
C pH7.0
D pH8.5
E
pH10.0
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F pH11.5
酸性
中性
碱性
转化子R4、G2与野生菌株在PDA培养基的菌落直径测量
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❖转化子的产孢量、细胞壁降解酶
产孢量
纤维素降解酶
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