药物分析课件第13章B-生化药物和基因工程药物分析概念

2。ＨＰＬＣ系统测试
ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个 峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别 为0. 4%,0 .6%和0. 8%,峰面积的ＲＳＤ分别为 0 .7%,0 .8%和0 .8%。ｒｈＩＬ 11对照品37℃ 酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次, 结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生 21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均 分别小于1 .0%,5 .4%和9. 8%,表明本系统误差 小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分析。
1。酶切条件 取浓度为3ｍｇ· ｍＬ-1的样品0 4ｍＬ对1%Ｎ Ｈ 4 ＨＣＯ 3 充分透析,然后取透析样品250μＬ至 微量进样瓶,加0 3ｍｇ· ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰 蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切, 每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌ ｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析, 直至ｒｈＩＬ 11完全酶解。按此方法摸索最佳 酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ 11已被完全酶切, 酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致, 即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。
NH
NH-C O -
H2N-C -NHC HC H2C H2-C H-C O O C 5 2 2H
253nm处的A随酶促反应递增，根
据酶活力单位定义计算酶活力。
酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能
转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性
单位。
测定： 空白：底物溶液 + 0.001mol/L HCl
供试品溶液 + 底物溶液 测定：每隔 30 s， 读取A，共 5 min
计时 摇匀
。+ 25.0 C — 0.5 。 C
每30s A的改变：0.015～0.018，
呈线性关系的时间不得少于3min。
A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白 酶单位。 供试液的A每分钟改变
A 1 - A2 T
相当于的单位数为
0.003 : 1 = A1 - A2 T : X
A1 - A2 0.003T
酶反应进程曲线 纵坐标为底物或产物的变化 量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速 度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。 酶浓度曲线 纵坐标为反应速度，横坐标为酶 量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适 宜。
酶活力测定的要求：测得的反应速度 必须和酶浓度有线性的比例关系，这 也是检验酶反应和测定系统是否适宜、 正确的标准。
2）酶促反应的条件及影响因素 底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。 pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、
适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。
温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或
37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。
辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要
相应的辅酶。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
空白和对照试验：
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练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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空白试验：是指杂质反应和自发反应引
起的变化量，它提供的是未知因素的影响。
空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二 者都加（酶预先经过失效处理）。 对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测 得的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类 加热：使酶失效 酶反应 不同的时间取样 终止反应 测定
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱
完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是
稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品
比较有20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和 峰面积均明显较小,且在第9和第10 峰之间多一 个峰,说明该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ 公司生产的ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 荧光分光光度法 酶偶联测定法 旋光法 电化学测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 浓度：A：0.575～.0585 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 N-苯甲酰-L-精氨酸
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化 学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力 越高。
酶反应速度可以用单位时间反应底 物的减少或产物的增加来表示。 通常酶活力测定时，先制备酶反应 进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速 度的测定，求得酶的浓度或含量。
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2 0.003TW
P=
A1—A 2 0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构 及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用 的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微 量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图 法。