项目研究-一种治疗真菌病的基因工程药物

一种治疗真菌病的基因工程药物

——赛内汀的研制

病原微生物是危害人类健康的一大杀手，千百年来人类为此付出了巨大的代价。真菌病，尤其是浅部真菌病，在我国较为常见。近几年来，随着免疫抑制剂的广泛应用，烧伤抢救、放射治疗、器官移植的广泛进行，特别是免疫缺陷患者，尤其是艾滋病患者的不断增加，真菌病的发病率有逐渐增加的趋势。据报道艾滋病患者中约有1/3并发各种真菌病而致死。目前临床上应用的抗真菌药物主要有2大类，一类是化学制剂：包括染料类制剂，如龙胆紫、结晶紫；碘制剂，如碘化钾、聚维酮；脂肪酸类制剂，如十一烯酸、十一烯酥锌；咪唑类药物，如克霉唑、咪康唑；丙烯胺类制剂，如萘替芬、特比萘芬；以及其他化学制剂，如土槿酸、氟胞嘧啶等。另一类是抗生素类药物：包括多烯类抗真菌抗生素，如制霉菌素、碘古霉素等；非多烯类抗真菌抗生素，如灰黄霉素、萨拉霉素。近几年来，也出现了一些新的抗真菌新药如阿莫芬类、两性霉素B脂质体、萨普康唑、β-1,3葡聚糖合成酶抑制剂等等。这些抗真菌药物大都是通过破坏真菌的代谢途径或阻断大分子的生物合成来达到抗真菌效果，这样就容易使病原真菌产生抗药性；同时对宿主细胞也产生了一定的毒性。目前临床上对病原细菌的防治也仍然局限于抗生素类药物。抗生素类药物的使用对抑杀细菌起了极其重要的作用，但同时也造成了耐药性菌株的产生和人体的过敏反应。随着生物工程特别是基因工程技术的迅猛发展，蛋白质及多肽类药物不断问世。蛋白质及多肽类药物是当今生物技术及制药工业中最为活跃的领域之一，已经显示出了巨大的社会效益和经济效益。美国FDA已批准的蛋白质及多肽类药物就有人胰岛素、人生长激素、干扰素（INF-α、β、γ）、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）、促红细胞生成素（EPO）、粒细胞集落刺激因子（G－CSF）、白细胞介素－2（IL-2）等。利用基因工程手段，在宿主生物中表达生产重组蛋白及多肽，然后分离纯化表达产物，用于药物的研制及开发，已成为生物制药的重要组成部分。抗菌肽是生物体免疫诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000-7000D左右，由20-60个氨基酸残基组成。目前报道的抗菌肽类，大多对细菌具有广谱的抗性。但对丝状病原真菌无明显的抑杀作用。令人欣喜的是，Pascale Fehlbaum等在E.coli 诱导的斑腹刺益蝽（Podisus.maculiventris）的血淋巴中分离了一种21aa的多肽－Thanatin，研究发现，Thanatin对细菌和真菌都具有广谱抗性。它抑制的细菌包括革兰氏阳性菌：浅绿气杆菌

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(Aerococcus viridans),枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；革兰氏阴性菌：大肠杆菌（E.coli）,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella trphimurium）,肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）；抑制的真菌有：粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）,灰色葡萄孢菌（Botrytis cinerea）,绿色木霉（Trichoderma viride）,黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）,烟曲霉（Aspergillus fumigatus）,从赤霉菌（Nectria haematococca），甘蓝链孢菌（Alteranria brasstcola），须发癣菌（Trechophyton mentagrophytes）等.致病真菌流行病学动态研究表明，最近几年来，须发癣菌一直保持着较高的发病率，占真菌病的10－20％，丝状病原真菌也具有较高的发病率，而抗真菌肽Thanatin对须发癣菌和丝状病原真菌都具有较强的抑杀作用。本设计利用基因工程方法，构建了Thanatin 同向串联四拷贝基因，将其转化到酵母中表达，然后将分离纯化的活性成份研制成抗真菌的基因工程药物－赛内汀（Thanatin的谐音）。同时对药物的活性、稳定性、代谢及安全性等进行检测与分析。目前，关于抗真菌的多肽及蛋白质药物，研究较少，还未见相应的产品投放市场，希望本研究能在此领域填补国内空白，开发出我国具用自主知识产权的基因工程药物，用于临床真菌病及细菌病的防治。

第一章Thanatin 同向串联四拷贝基因的构建

小分子多肽在基因工程表达中，存在着表达量低，表达产物易降解，检测和纯化困难等缺点。多拷贝基因融合表达，将会大大克服上述缺点，既能增加表达量，又能使表达产物不易被降解，同时又便于检测及表达产物的纯化。但并非外源基因拷贝数越多越好，高水平的表达还会阻碍产物的分泌。对此，本设计构建了Thanatin 同向串联四拷贝基因，进行融合表达，以期提高分泌表达水平。

根据毕赤酵母喜好的高表达优越密码子，设计了Thanatin基因两条链的碱基序列，在其5‘端分别加上了多肽切割中溴化氰识别的蛋氨酸密码子（ATG/TAC）,作为粘性末端。同时设计了含有Eco RI 和Xho I酶切位点的接头，既用于串联四拷贝基因的连接，又方便以后的克隆和表达。

1方法

1．1基因片断及接头的设计

基因片断1：

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