第二十六章基因工程药物new
基因工程制药.doc
基因工程制药自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，基因工程药物就成为各国政府和企业投资研究开发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。
目前，世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点，展开了激烈的市场竞争。
到1999年底为止，全球至少已有近3000家生物工程公司在从事生物药品与基因产品研究与开发。
据不完全统计，在欧美诸国，已经上市的基因工程药品接近一百种，大约还有超过300种以上的药物处于临床试验阶段，约2000种在研究开发中，形成了一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。
基因工程制药技术的发展，掀起了对传统制药行业的巨大的冲击波。
基因工程制药技术的快速发展，基因工程药物广阔的应用范围和更小的副作用使得研发机构和制药企业跃跃欲试；基因工程制药本身为高科技技术，涉足其中的上市公司在股市上的良好表现吸引了投资者的关注。
基因工程制药行业成为制药行业和投资方面关注的焦点，适时推出，本报告分为五个部分：基因工程制药发展简介、中国基因工程制药行业现状、中国基因工程制药市场状况、中国基因工程制药行业发展趋势和附录。
基因工程制药发展简介部分介绍了基因工程制药的概念、世界基因工程制药史上的重大事件和研究进展方面。
同时还介绍了世界上几个主要国家（美国、欧洲、加拿大、日本和中国）的基因工程制药发展现状和趋势，包括生物公司情况、研发投入情况和生物技术制药公司运营特点，以及生物技术药品的销售情况和在医药市场中逐步扩大的市场份额趋势。
由于美国在世界生物制药和基因工程制药方面处于领先地位，本部分重点介绍了美国基因工程制药行业的状况。
中国基因工程制药行业现状部分介绍了中国基因工程制药行业的发展的初创阶段、大发展阶段和后基因时代三个阶段；中国基因工程药物的研究成果和批准上市情况；由于基因工程制药行业属于高科技行业，且无论国内还是国外股市上，生物制药尤其是涉及基因工程制药的公司表现良好，所以本报告专门介绍了中国国内投资基因制药行业的上市公司，包括这些上市公司的分类，在基因工程制药方面的投入情况，并对其中表现突出的三家公司的经营管理能力、盈利能力和成长性进行了比较分析；同时，本部分还对我国基因工程制药行业存在的主要问题，如研发能力和投入相对不足，同中产品生产厂家过多以及缺乏产业化机制等问题进行了分析。
基因工程药物
基因工程药物周长征第一部分概述一、基因工程药物（一）基因工程药物的概念基因工程药物是以基因组学研究中发现的功能性基因或基因的产物为起始材料，通过生物学、分子生物学或生物化学、生物工程等相应技术制成的、并以相应分析技术控制中间产物和成品质量的生物活性物质产品，临床上可用于某些疾病的诊断和治疗。
基因药物类型广泛，包括重组蛋白质药物、人源化单克隆抗体、基因治疗药物、重组蛋白质疫苗、核酸药物等10多种类型。
生产基因工程药物的基本方法是：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药物或疫苗。
若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就称为基因治疗。
例如，乙肝表面抗原（HBSAg）的产生也受DNA 调控。
利用基因剪切技术，用一种“基因剪刀”将调控HBSAg的那段DNA剪裁下来，装到一个表达载体中（所谓表达载体，是因为它可以把这段DNA的功能发挥出来）再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等；最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，生产出大量我们所需要的HBSAg（乙肝疫苗）。
把一定量的HBSAg注射入人体，就使机体产生对HBV抗衡的抗体。
机体依靠这种抗体，可以清除入侵机体内的HBV。
过去，乙肝疫苗的来源，主要是从HBV 携带者的血液中分离出来的HBSAg，这种血液是不安全的，可能混有其他病原体的污染。
此外，血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应犹如杯水车薪，远不能满足全国的需要。
基因工程疫苗解决了这一难题。
干扰素具有广谱抗病毒的效能，是一种治疗乙肝的有效药物，国际上批准唯一一种治疗丙型病毒性肝炎的药物。
通常情况下人体内干扰素基因处于休眠状态，血中一般检测不到。
只有在发生病毒感染或受到干扰素诱导物的诱导时，人体内的干扰素基因才会产生干扰素，但其数量微乎其微。
生物技术药与基因工程药物
生物技术
生物技术属于当今国际上重要的高技术领域，被认为是21世纪科学技术的核心力量。生物技术从广义的角度 来说，就是人类对生物资源的利用、改造并使之为人类自身服务。纵观生物技术发展历史，也是由简单到复杂， 由传统到现代的发展过程，经历了三个重要的历史时期。
传统的生物技术阶段—酿酒与制醋
早在公元前几千年就有了酿酒和制醋的生产工艺，简而言之，传统生物技术阶段就是酿造技术。很长时间内 人们都不知道这些技术的内在原因。直到发明了显微镜，人类知道自然界有微生物的存在，才明白酿酒与制醋和 微生物以及发酵之间的关系。从19世纪末到20世纪30年代，陆续出现了许多产品的工业发酵。当然这只是早期的 生物技术运用到实际生产中去，并非完全应用到医药行业中来。
生物技术药与基因工程药物
基因工程制药碎片网载基因工程制药
基因表达的调控是一个复杂的过程，如何有效调 控基因的表达以达到治疗目的，是基因工程制药 中的一大挑战。
细胞和组织特异性
如何将药物准确地递送到病变细胞或组织，避免 对其他细胞或组织的损伤，是基因工程制药中的 另一个技术挑战。
伦理和法律问题
人类基因编辑
基因工程制药涉及到人类基因编辑，如何确保技术的安全性和伦理 的合理性，是当前面临的重要问题。
知识产权保护
基因是天然存在的，如何保护知识产权，避免侵权行为，是基因工 程制药中需要关注的问题。
法规监管
基因工程制药涉及到法规监管问题，如何制定合理的法规和监管政策， 以确保技术的安全性和有效性，是当前面临的重要挑战。
社会和经济影响
01
社会接受度
基因工程制药是一种新兴的技术，如何获得社会的广泛接受和支持，是
未来发展方向和前景
创新药物的研发
随着基因工程技术的不断发展，未来将有更多的创新药物 问世，为患者提供更有效的治疗方案。
个性化医疗的发展
基因工程制药技术的发展将推动个性化医疗的进步，根据 患者的基因组信息量身定制治疗方案，提高治疗效果。
跨界合作与国际合作
未来将有更多的跨界合作和国际合作，共同推动基因工程 制药领域的发展。同时，国际合作将有助于制定统一的法 规和标准，促进技术的全球推广和应用。
利用基因工程技术进行细胞培养，生 产生物药物。
利用基因工程技术生产生物催化剂， 用于生物制药生产。
蛋白质表达
通过基因工程技术表达蛋白质，生产 生物药物。
04
基因工程制药的挑战与前景
技术挑战
1 2 3
基因测序技术
随着基因测序技术的不断发展，如何提高测序速 度、降低成本和提高准确性是当前面临的重要挑 战。
基因工程药物论文
摘要：在现代生物技术日益发展的今天，新兴生物技术产业迅速崛起，不断发展壮大。
人们对生活的要求越来越高，对身体也越来越在乎，故而药物治疗也越来越重要。
其中以基因工程药物所占比例最高，本文主要阐述个人对基因工程药物的理解以及基因工程在我国的开发和发展。
关键字：基因药物、临床应用、基因药物品种导论：基因药物又称生物技术药物，是根据人们的愿望设计的基因，在体外剪切组合，并和载体DNA连接，然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞)，使目的基因在靶细胞中得到表达，或者表达的目的蛋白质纯化及做成制剂。
目酌人类60％以上的生命科学成果集中应用于医药工业。
这些药物包括细胞因子、菌苗、疫苗、毒素、抗原、血清、DNA重组产品、体外诊断试剂等等，在预防、诊断、控制乃至消灭传染病，保护人类健康，延长生命过程中发挥着越来越重要的作用。
基因工程药物引入医药产业，由此引起了医药工业的重大变革，使得基因工程药物产业成为最活跃、发展最快的产业之一。
正文：一．基因工程药物品种的开发（1）利用基因工程细菌等表达人类一些重要基因片段，可产生具生理活性的肽类和蛋白质类药物。
这一技术可以大量廉价生产以前不敢想象的医药产品。
如应用传统的技术方法提取生长激素抑制素（Somatostatin）一毫克需要用十万只羊的下丘脑，所要耗费的资金大约等于经由人造卫星从月球上搬回一公斤石头。
而用基因工程方法生产这一激素只需十公升大肠杆菌培养液，其价格大约为每毫克0.3美元。
这就是基因工程这一高技术的诱人之处，有着难以估量的社会效益和经济效益。
（2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型。
在新药研究开发中日益广泛使用的各种酶、受体筛选模型所需的靶酶和受体往往来自动物体内，因而数量有限而不利于采用机器人进行大量筛选。
应用基因重组技术将一些靶酶的活性中心或受体的配体、亚基等在微生物中大量表达可以解决这一难题。
据报道，最近β-肾上腺受体，5-HT受体和毒蕈碱M[,1]受体等已在大肠杆菌或酵母菌中表达成功，并已证实这些受体的功能与来自哺乳动物组织的受体完全相同。
基因工程药物 ppt课件
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基因工程药物
• 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质， 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操 作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体 细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在 受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病 的蛋白质，即基因疫苗或药物。
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工程菌
• 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一 般称为“工程菌”。
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目录
六6 采取的措施
五5 基因工程药物的安全性及质量 检控
四4 基因工程药物的技术路线
三3 基因工程药物的特点
二2 利用微生物生产药物的优越性
一1 基因工程药物的种类
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一、基因工程药物的种类
• 用于基因治疗的基因工程药物除了能杀死不正常细胞外可能同时伤害正 常的细胞。
• 当用于生产基因工程药物的重组体发生突变或对目的产品进行修饰、纯 化时，都有可能产生或带入一些与目的产品相关联的、结构相差甚微而 生物活性迥异的变异体。
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六、采取的措施
• 构建基因工程药物表达载体时给目的基因组装诱导型启动子，使 其在诱导条件下才能有效表达。
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• 目前对基因工程操作的后果还存在一定程度的不可预测性和不可控制性， 转基因生物有可能隐藏某些危害性。
• 基因工程药物与一般药品不同，它来源于活的生物体，在发酵、细胞培 养、产品分离纯化等生产过程有其固有的易变性，导致基因工程药物质 量的不稳定性。
• 在制备的基因工程药物中残留的抗生素有可能使病人产生对抗生素的抗 药性。
基因工程药物
基因工程药物蛋白质是生命活动最重要的物质之一，很多蛋白质与人类的疾病密切相关。
大家所熟悉的侏儒症与病人缺少生长激素有关；一些糖尿病人则是由胰岛素合成不足引起的。
在DNA重组技术出现之前，大多数的人用蛋白质药物主要是从人(如血液、尿液)或动物的组织或器官中提取的，成本特别高、产率和产量都很低，供应十分有限。
并且由人体来源的材料进行提取，很难保证这种蛋白质药物不被某些病原体，如肝炎病毒、艾滋病病毒的污染，所以存在不安全因素。
1972年DNA重组技术诞生，直到 1982年出现世界第一个基因工程药物。
基因工程药物开始进入人们的视线并逐渐得到重视。
基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，即目的基因。
将目的基因用DNA重组技术的方法连接在载体DNA上，然后将载体导入可以大量生产的靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药物或疫苗。
目前基因工程药物主要分为四类：激素类及神经递质类药物；细胞因子类药物；酶类药物与凝血因子；基因工程活疫苗。
这里就只做简单介绍，有兴趣的同学可以去详细了解。
我们来看一下基因工程药物合成的步骤：首先是目的基因DNA的取得——构建DNA重组体——构建工程菌——目的基因的表达——外源基因表达产物的分离纯化——最后是进行产品的检验。
经临床试验才可投入市场。
我们来了解一下基因工程药物的发展历程自1972年DNA重组技术诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。
1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。
到1996年美国已拥有1300多家专门从事生物公司，70%从事生物医药开发。
我国基因工程药物的研究和开发起步较晚，1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素α1b，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。
基因工程药物
作者单位：华中科技大学同济医学院,
刊名：
医药导报
英文刊名： HERALD OF MEDICINE
年，卷(期)： 2001,20(3)
被引用次数：6次
引证文献(6条)
1.林凤抗精神病药物基因组学研究进展[期刊论文]-北方药学 2010(3)
2.张海霞.孙桂珍.张文静我国基因工程药物的研究动态[期刊论文]-山东农业大学学报(自然科学版) 2008(4)
这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。
HBV
DNA
!
"
“基因剪刀”切割
HBsAg
!
"
“基因剪刀”切割
新质粒
大肠杆菌
质粒
#$
#—###$
%
含有转入基因质粒的受体细胞
&####受体细胞
!
"
大量繁殖（大肠杆菌或酵母菌）
""
链激酶
乙肝疫苗类
成纤维细胞生长因子
红细胞生长素
胰岛素
人生长激素
粒细胞集落刺激因子
溶血栓。
预防乙肝。
!创伤修复；"间歇性外周血管病。
!肾性贫血；"与手术相关的贫血；#恶
性贫血；&癌症化疗引起的贫血。
糖Hale Waihona Puke 病。 !侏儒症；"儿童矮小；#与艾滋病有关
HBsAg。把一定量的
HBsAg注射入人体，使
机体产生抗
HBV的抗体。通过这种抗体，清除侵入机体的
基因工程药物
血液替代品的研究与开发
血液制品是采用大批混合的人体血浆制成的, 由 于人血难免被各种病原体所污染 ,如艾滋病病毒 及乙肝病毒等 ,通过输血而使患者感染艾滋病或 乙型肝炎的案例时有发生,因此利用基因工程开发 血液替代品引人注目
实例——
用基因工程合 成人胰岛素的 两种方法
胰岛素与糖尿病
糖尿病是个历史悠久的慢性代谢性疾病， 有文字记载的历史已有上千年。但对糖尿 病病因的了解和治疗上有实质上的进展还 不到一百年。 胰岛素的发现对改变糖尿病患者的命运及 揭示糖尿病的病因及相关影响因素意义重 大。
胰岛素的结构
S S
GLY ILE VAL GLU GLN CYS CYS THR SER ILE CYS SER LEU TYR GLN LEU GLU ASN TYR CYS ASN
A链
S S
S S
B链
PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE PHE TYR THR PRO LYS THR
（2）同种产品生产厂家过多
(3) 新药研发创新的体制尚未形成 (4) 医药市场混乱
3、国外现状
上市药类种类多，幅面广 研发机制成熟 投资规模大，抗风险能力强 利润大，投资回报率高
4、发展方向
开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、 艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋 白质和核酸等新生物技术产品。此方面开 发重点将主要是干扰素、生长激素与 T-PA （组织型纤溶酶原激活剂） 等。 选择一批市场前景好的生物技术产品及疫 苗、诊断用单克隆抗体进行开发 （如乙肝 基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂）
基因工程药物
细胞培养技术
细胞株的选择
选择适合表达目的蛋白的细胞株，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物 细胞等。
细胞培养条件的优化
调整培养基成分、温度、pH值等参数，优化细胞生长和蛋白表 达条件。
细胞扩增与蛋白表达
在优化后的培养条件下，扩增细胞并诱导目的蛋白的表达。
干细胞治疗
利用基因工程手段对干细胞进行改造和优化，提高其治疗效果和安全性，常用 于治疗遗传性疾病、组织损伤和退行性疾病等。
05
基因工程药物在临床应用中的优势 与挑战
个性化治疗方案设计
01
02
03
精准医疗
基因工程药物可以根据患 者的基因信息，设计个性 化的治疗方案，实现精准 医疗。
预测药物反应
通过分析患者的基因变异 ，可以预测其对特定药物 的反应，从而避免不必要 的用药和副作用。
06
基因工程药物市场前景预测与行业 发展趋势分析
市场规模增长趋势预测
随着基因测序技术的不断发展和成本降低， 基因工程药物市场规模将持续增长，预计未 来几年将保持高速增长态势。
新兴市场如亚洲、非洲等地区的医疗需求增 长，将带动全球基因工程药物市场的进一步 扩张。
随着个性化医疗和精准医疗的兴起，基因工 程药物将更广泛应用于罕见病、肿瘤等领域 ，进一步推动市场规模扩大。
政策法规与行业标准
政策法规
各国政府对基因工程药物的研发、生产、销售和使用都有严 格的法规监管，包括药品审批、生产质量管理规范（GMP） 认证、临床试验管理等方面。
行业标准
国际药品监管机构如FDA、EMA等制定了一系列基因工程药 物研发和审批的技术标准和指南，为药物的研发提供了规范 和指导。此外，行业组织也制定了相关标准，如生物类似药 的评价标准等。
基因工程药物
药物研发流程2010年4月药物从最初的实验室研究到最终摆放到药柜销售平均需要花费12年的时间。
进行临床前试验的5000种化合物中只有5种能进入到后续的临床试验，而仅其中的1种化合物可以得到最终的上市批准。
总的来说新药的研发分为两个阶段：研究和开发。
这两个阶段是相继发生有互相联系的。
区分两个阶段的标志是候选药物的确定，即在确定候选药物之前为研究阶段，确定之后的工作为开发阶段。
所谓候选药物是指拟进行系统的临床前试验并进入临床研究的活性化合物。
研究阶段包括四个重要环节，即靶标的确定，模型的建立，先导化合物的发现，先导化合物的优化。
一、靶标的确立确定治疗的疾病目标和作用的环节和靶标，是创制新药的出发点，也是以后施行的各种操作的依据。
药物的靶标包括酶、受体、离子通道等。
作用于不同的靶标的药物在全部药物中所占的比重是不同的。
以2000年为例，在全世界药物的销售总额中，酶抑制剂占32.4%，转运蛋白抑制剂占16.0%，受体激动剂占9.1%，受体拮抗剂占10.7%，作用于离子通道的药物占9.1%等等。
目前，较为新兴的确认靶标的技术主要有两个。
一是利用基因重组技术建立转基因动物模型或进行基因敲除以验证与特定代谢途径相关或表型的靶标。
这种技术的缺陷在于，不能完全消除由敲除所带来的其他效应（例如因代偿机制的启动而导致的表型的改变等）。
二是利用反义寡核苷酸技术通过抑制特定的信使RNA对蛋白质的翻译来确认新的靶标。
例如嵌入小核核糖核酸（snRNA）控制基因的表达，对确证靶标有重要作用。
二、模型的确立靶标选定以后，要建立生物学模型，以筛选和评价化合物的活性。
通常要制订出筛选标准，如果化合物符合这些标准，则研究项目继续进行；若未能满足标准，则应尽早结束研究。
一般试验模型标准大致上有：化合物体外实验的活性强度；动物模型是否能反映人体相应的疾病状态；药物的剂量（浓度）——效应关系，等等。
可定量重复的体外模型是评价化合物活性的前提。
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是一种人工膜，可以和细胞膜融合从而实现外源基因的转染，可以做到 缓释，毒性低。
目的基因与载体的连接
方法一：加同聚尾连接。
用3‘末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3’末端带上互补 的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上 polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能 自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连 接酶封口。
发展现状
美国作为最早开展基因及基因工程研究的国家，自基因工程诞生以来处 于世界领先地位。拥有生物技术公司2000余家，其中300余家上市公司。欧 洲约有1000余家生物技术公司。亚洲的日本，韩国和印度也获得了极大的发 展。
我国生物技术起步较晚，但是受到了国家的高度重视，发展速度也是十 分惊人。2019年我国自主生产了第一个基因工程药物重组干扰素。目前世界 上排名前十位的重要基因工程药物我国都能自主生产。
目的基因的获取
反转录法
以富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA， 以此为模板进行PCR扩增，最终合成编码多肽的双链DNA序列，这是制取真 核生物目的基因常用的方法。
人工合成法
化学合成法：利用特殊的化学试剂将相邻的两个核苷酸以3’, 5’-磷酸二酯键 相连，逐渐延长获得目的基因序列。
所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD 序列，以便转录后能顺利翻译。
柯斯质粒载体
柯斯质粒是一类人工构建的特殊质粒载体。含有λDNA的cos序列，质粒 复制子，抗药性标记，一种或几种限制性内切酶单一位点。具有λ 噬菌体和质 粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45kb。
腺病毒载体
腺病毒可以携带外源基因通过受体介导的内吞作用进入细胞核内，但不 整合入基因组中，实现高效转染，复制。转染效率达100%。
可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深 入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。
利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。
利用基因工程技术改良药物，获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
基因工程菌的制备
目的基因的获取 载体的制备
目的基因与载体的连接 转化
转化子的鉴定和鉴别
酿酒酵母
丝状真菌 特点：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和
糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲 霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺
哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培 养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。 哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度 较稀。
Southern印迹杂交
一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支 持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜 上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子 杂交过程。
基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中转录，翻译以及后加工 过程。以下是主要的表达系统：
产物的产量、产率高，产物容易提取纯化
真核
酵母，真菌， 昆虫，动物细胞
原核细胞
大肠杆菌 其为不需要修饰蛋白的首选
表达宿主细胞。结构功能了解透 彻，技术成熟。另外大肠杆菌可 以进行高密度培养，培养介质简 单，价格低廉，容易操作，优化 手段丰富。
原核
不存在信号肽，产品多为胞内产物；
电击法：使用瞬时高压电处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下 发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入 细胞内部。这种方法很直接，转化效率很高。做酵母等真核生物转化时一 般都是电击。
转化子的筛选和鉴定
重组质粒转化的细胞在全部受体细胞中只占极少数，需要从大量细胞中 筛选出海鸥重组子的菌株，主要的方法有抗药性筛选，单菌落快速电泳，序 列测定，Southern印迹杂交等。
（sub-clone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。
2.1 载体----表达载体必须具备的条件
载体能独立地进行复制：载体本身就是一个复制子，具有复制起点，分 为严紧型和松弛型，前者伴随染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝 数仅1~3个，后者的复制不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝数可高达 3000个
原核
链霉菌
真核细胞
酵母 研究基因表达调控的最有效的单细胞真核
生物。 特点： ① 真核生物细胞，故有后翻译过程； ② 基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； ③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式； ④ 基因操作与原核生物相似； ⑤ 可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分
泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。
真核
我国已批准上市的基因工程药物和疫苗表26-1
基因工程药物的特点
稳定性差，易腐败。 使用用量低，药理活性高。 具有细胞和组织特异性。 给药方式有特定要求。
主要的基因工程药物
基因工程技术的优点
可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、 细胞因子等），为临床使用提供有效的保障。
原核
枯草芽孢杆菌
链霉菌
其是重要的工业微生物，近年来作 为外源基因表达体系正日益受到人们 的重视。其主要特点是：不致病、使 用安全，分泌能力强，可将表达产物 直接分泌到培养液中，具有糖基化能 力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱， 可以作为理想的受体菌。现已构建了 一系列有效的载体，下游培养工艺也 已经成熟。
当然，现在我们不仅要继续利用大肠杆菌和酵母，研究清除影响 基因表达的各种因素之间的关系，提出更有效的解决方法，而且 还要寻找更好的适合于不同外源基因表达的微生物宿主菌。
2. 大肠杆菌体系中的基因表达
大肠杆菌表达体系的优点： 积累了充足经验，有多种载体可供应用； 操作安全，致病能力低 ； 技术操作简便，培养条件简单， 成本相对低得多，大规模发酵经济 ； 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆
T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以 “缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
宿主细胞转化
含目的基因的表达载体构建完成后，需要导入宿主菌种进行扩增或表
达，通常采用转化法。所谓转化就是指在特殊状态下即感受态状态时，可摄
取外源遗传物质，摄入的外源物质可以单独复制也可以整合到宿主细胞染色
体一同复制，是宿主菌具有新的形状。宿主细胞感受态的制备有多种方法包
括：冷氯化钙，氯化铝，电转法等。
重组质粒
重组质粒 短暂热刺激或电击
野生型E.coli
CaCl2 低温
感受态细胞
转化方法
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混 合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长 数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到 表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
表达体系 综述
虽然各种微生物从理论上来说都可以用于基因表达，但由于克隆 载体、DNA 导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广 泛的宿主菌还是 大肠杆菌 和酵母。一方面它们的遗传背景研究得 比较清楚，建立了许多适合它们的克隆载体和 DNA 导入方法， 另一方面许多外源基因在这两种宿主菌中表达成功，积累了许多 实际操作经验。
质粒载体
质粒载体是存在于细菌（酵母）细胞质中的 一种独立于染色并能自主复制的一类遗传物质。 大多数质粒成环状。通常是游离于染色体之外 单独复制，也可在特殊状况下整合入基因组 DNA中共同复制。提取大量完整的质粒是制备 重组质粒的前提基础。（天然：pSC，RDF；改 进：pUC，pBR，pET）
λ噬菌体载体
优点：
不易自身环化。 因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 通用性好。
目的基因与载体的连接
方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工 接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的 寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性 末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点， 为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制 酶切位点。
抗性培养基筛选
单菌落快速电泳
单菌落不需培养扩增，快速裂解单菌落，使内部的质粒释放出来，直接 上电泳检测，判断是否还有重组质粒，也可以配合以PCR检测是否能扩增出 目的基因。
序列测定
Sanger双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要 先做一个PCR。过程中，双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）可能随机的被加入 到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子， 一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结 果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的 方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总 DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发 出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧 光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T， G，C中的哪一个。
分泌能力不足，常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经 过变性和复性处理才能恢复其生物活性；