第二十六章基因工程药物new

质粒载体
质粒载体是存在于细菌（酵母）细胞质中的 一种独立于染色并能自主复制的一类遗传物质。 大多数质粒成环状。通常是游离于染色体之外 单独复制，也可在特殊状况下整合入基因组 DNA中共同复制。提取大量完整的质粒是制备 重组质粒的前提基础。（天然：pSC，RDF；改 进：pUC，pBR，pET）
λ噬菌体载体
T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以 “缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
宿主细胞转化
含目的基因的表达载体构建完成后，需要导入宿主菌种进行扩增或表
达，通常采用转化法。所谓转化就是指在特殊状态下即感受态状态时，可摄
目的基因的获取
反转录法
以富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA， 以此为模板进行PCR扩增，最终合成编码多肽的双链DNA序列，这是制取真 核生物目的基因常用的方法。
人工合成法
化学合成法：利用特殊的化学试剂将相邻的两个核苷酸以3’, 5’-磷酸二酯键 相连，逐渐延长获得目的基因序列。
取外源遗传物质，摄入的外源物质可以单独复制也可以整合到宿主细胞染色
体一同复制，是宿主菌具有新的形状。宿主细胞感受态的制备有多种方法包
括：冷氯化钙，氯化铝，电转法等。
重组质粒
重组质粒 短暂热刺激或电击
野生型E.coli
CaCl2 低温
感受态细胞
转化方法
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混 合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长 数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到 表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
发展现状
美国作为最早开展基因及基因工程研究的国家，自基因工程诞生以来处 于世界领先地位。拥有生物技术公司2000余家，其中300余家上市公司。欧 洲约有1000余家生物技术公司。亚洲的日本，韩国和印度也获得了极大的发 展。
我国生物技术起步较晚，但是受到了国家的高度重视，发展速度也是十 分惊人。2019年我国自主生产了第一个基因工程药物重组干扰素。目前世界 上排名前十位的重要基因工程药物我国都能自主生产。
当然，现在我们不仅要继续利用大肠杆菌和酵母，研究清除影响 基因表达的各种因素之间的关系，提出更有效的解决方法，而且 还要寻找更好的适合于不同外源基因表达的微生物宿主菌。
2. 大肠杆菌体系中的基因表达
大肠杆菌表达体系的优点： 积累了充足经验，有多种载体可供应用； 操作安全，致病能力低 ； 技术操作简便，培养条件简单， 成本相对低得多，大规模发酵经济 ； 真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆
电击法：使用瞬时高压电处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下 发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入 细胞内部。这种方法很直接，转化效率很高。做酵母等真核生物转化时一 般都是电击。
转化子的筛选和鉴定
重组质粒转化的细胞在全部受体细胞中只占极少数，需要从大量细胞中 筛选出海鸥重组子的菌株，主要的方法有抗药性筛选，单菌落快速电泳，序 列测定，Southern印迹杂交等。
产物的产量、产率高，产物容易提取纯化
真核
酵母，真菌， 昆虫，动物细胞
原核细胞
大肠杆菌 其为不需要修饰蛋白的首选
表达宿主细胞。结构功能了解透 彻，技术成熟。另外大肠杆菌可 以进行高密度培养，培养介质简 单，价格低廉，容易操作，优化 手段丰富。
原核
大肠杆菌
大肠杆菌中的表达的缺点：
原核
不存在信号肽，产品多为胞内产物；
柯斯质粒载体
柯斯质粒是一类人工构建的特殊质粒载体。含有λDNA的cos序列，质粒 复制子，抗药性标记，一种或几种限制性内切酶单一位点。具有λ 噬菌体和质 粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45kb。
腺病毒载体
腺病毒可以携带外源基因通过受体介导的内吞作用进入细胞核内，但不 整合入基因组中，实现高效转染，复制。转染效率达100%。
大肠杆菌表达系统 酵母表达系统
植物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 动物细胞表达系统
影响基因表达的因素
1. 宿主菌的选择
容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料；
原核
大肠杆菌 枯草杆菌
不致病、不产生内毒素；
发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；
容易进行代谢调控；
容易进行DNA重组技术操作；
所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD 序列，以便转录后能顺利翻译。
原核
链霉菌
真核细胞
酵母 研究基因表达调控的最有效的单细胞真核
生物。 特点： ① 真核生物细胞，故有后翻译过程； ② 基因组小，仅为大肠杆菌的4倍； ③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式； ④ 基因操作与原核生物相似； ⑤ 可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分
泌出胞外，分离纯化工艺相对简单。
真核
聚合酶链式反应：根据已经基因的核苷酸序列，设计引物，利用PCR技术分 段和成基因片段最终获得全长基因。
载体的制备
外源基因必须导入适合的细胞内才能实现克隆，表达。这一过程依赖于 载体的转运，外源基因片段与载体连接是DNA重组技术的关机步骤之一。 根据受体细胞的不同，载体的选择也是不同的，主要包括以下载体： 质粒载体 λ噬菌体 柯斯质粒 单M13噬菌体 动植物病毒的衍生物
脂质体载体
是一种人工膜，可以和细胞膜融合从而实现外源基因的转染，可以做到 缓释，毒性低。
目的基因与载体的连接
方法一：加同聚尾连接。
用3‘末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3’末端带上互补 的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上 polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能 自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连 接酶封口。
Southern印迹杂交
一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支 持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜 上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子 杂交过程。
基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中转录，翻译以及后加工 过程。以下是主要的表达系统：
抗性培养基筛选
单菌落快速电泳
单菌落不需培养扩增，快速裂解单菌落，使内部的质粒释放出来，直接 上电泳检测，判断是否还有重组质粒，也可以配合以PCR检测是否能扩增出 目的基因。
wenku.baidu.com
序列测定
Sanger双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要 先做一个PCR。过程中，双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）可能随机的被加入 到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子， 一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结 果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的 方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总 DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发 出荧光。由于ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧 光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T， G，C中的哪一个。
（sub-clone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。
2.1 载体----表达载体必须具备的条件
载体能独立地进行复制：载体本身就是一个复制子，具有复制起点，分 为严紧型和松弛型，前者伴随染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝 数仅1~3个，后者的复制不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝数可高达 3000个
酿酒酵母
丝状真菌 特点：有很强的蛋白分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和
糖基化等，而且其糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲 霉等）等又确认是安全菌株，有成熟的发酵和后处理工艺
哺乳动物细胞 哺乳动物细胞由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培 养液中，细胞培养成分完全由人控制，从而使产物纯化变得容易。 哺乳动物细胞分泌的基因产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。 但动物细胞生产慢，产率低，且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度 较稀。
λ噬菌体基因组长度48.5kb，基因组中处的一连串基因并非噬菌体形成所 必需的，若用外源DNA片段取代这个区域，不会影响噬菌体的形成，这也是λ 噬菌体能够作为质粒载体的的前提条件。通过人工改造得到的λ噬菌体载体可 以分为插入型和替换型。 插入型：可用于组建cDNA文库，可容纳10kb以下的片段。（组织细胞特异性） 替换型：可用于组建基因组文库，容纳20kb左右的片段。
优点：
不易自身环化。 因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。 用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 通用性好。
目的基因与载体的连接
方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工 接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的 寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性 末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点， 为了保护cDNA不受限制酶破坏，可在加接头前用甲基化酶修饰这些限制 酶切位点。
表达体系 综述
虽然各种微生物从理论上来说都可以用于基因表达，但由于克隆 载体、DNA 导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广 泛的宿主菌还是 大肠杆菌 和酵母。一方面它们的遗传背景研究得 比较清楚，建立了许多适合它们的克隆载体和 DNA 导入方法， 另一方面许多外源基因在这两种宿主菌中表达成功，积累了许多 实际操作经验。
可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深 入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。
利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。
利用基因工程技术改良药物，获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
基因工程菌的制备
目的基因的获取 载体的制备
目的基因与载体的连接 转化
转化子的鉴定和鉴别
应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴 定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达
应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。
2.1 载体----表达载体必须具备的条件
应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。
应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外 源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生 的mRNA较为稳定。
分泌能力不足，常形成不溶性的包含体，产物须在下游处理过程中经 过变性和复性处理才能恢复其生物活性；
不存在翻译后修饰作用；
翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余 一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应；
产生的内毒素难以除去；
产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。
枯草芽孢杆菌
分泌能力强，可以将蛋白 质产物直接分泌到培养液 中，不形成包含体。该菌 也不能使蛋白质产物糖基 化，另外由于它有很强的 胞外蛋白酶，会对产物进 行不同程度的降解，因此 在外源基因克隆表达的应 用中受到影响
原核
枯草芽孢杆菌
链霉菌
其是重要的工业微生物，近年来作 为外源基因表达体系正日益受到人们 的重视。其主要特点是：不致病、使 用安全，分泌能力强，可将表达产物 直接分泌到培养液中，具有糖基化能 力，变铅青链霉菌限制修饰能力弱， 可以作为理想的受体菌。现已构建了 一系列有效的载体，下游培养工艺也 已经成熟。
我国已批准上市的基因工程药物和疫苗表26-1
基因工程药物的特点
稳定性差，易腐败。 使用用量低，药理活性高。 具有细胞和组织特异性。 给药方式有特定要求。
主要的基因工程药物
基因工程技术的优点
可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、 细胞因子等），为临床使用提供有效的保障。