基因工程药物制造实例

用已知干扰素的DNA片断作为 探针挑选富有干扰素cDNA克隆
将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达
二、基因工程干扰素的制备
启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提
精提 半成品制备 半成品检定 分装
冻干
成品检定 成品包装
α2b干扰素生产过程
1.发酵
工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒 用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子 培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物 0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。
一、基因工程菌的组建
诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱
蔗糖密度梯度
获得寡A的mRNA
离心提取12s
的 mRNA
逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾
pBR322质粒
pBR322质粒加上dA或dC
退火获的杂交质粒
筛选抗四环素但对氨苄 青霉素敏感细菌克隆
转化大肠杆菌k12
扩增杂交质粒
d超滤器浓缩后，经Sephadex G50 分离。
e经SDS-PAGE检查。
f再经DE-52柱纯化。
三、质量控制标准和要求
⒈半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定
⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试
验、热原试验。
⒉成品检定
⑴物理性状 ⑵鉴别试验 ⑶水分测定 ⑷无菌试验 ⑸热原试验 ⑹干扰素效价测定 ⑺安全试验
一章回顾
基因工程技术：
将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转 入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞）， 实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在 工程菌内进行复制和表达的技术。
基因表达：
第十三节 基因工程药物制造实例
干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而 自然形成的一组复杂的蛋白质。
干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑 制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免 疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着 良好的临床应用价值。
干扰素是人体防御系统的重要组成部分。 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、 γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、 α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨 基酸。
发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物， 0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基 加入氨苄青霉素，防泡剂。30℃发酵8h，然 后在42℃诱导2-3h可完成发酵。每隔不同的 时间取发酵液，离心称量湿菌体。
2.产品的提取与纯化 a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液 中，冰浴条件下超声破碎； b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏 糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。 c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。
是我国已经批准上市的基因工程药物。
早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白 细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才 提取1mg 。
2003年抗非典期 间，江南大学与丽珠 集团苏州新宝制药厂 合作攻关，通过发酵 工程和生物制药工程 研制成功了重组人α2b干扰素口鼻腔喷雾 剂，解决了干扰素常 温保存稳定性问题。 在疫区特殊人群捐赠 使用，效果显著。
制备基因工程药物的基本过程
获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌 （或细胞）
培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤
半成品检定 成品检定 包装
质粒不稳定的原因？
⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质 粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件 有关。
⑵这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质 粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长 优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优 势菌。
结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。
融合蛋白
真核基因在原核细胞中表达的一种形式，原 核多肽和真核蛋白结合在一起。
非融合蛋白
在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的 mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌 多肽序列。
分泌型表达蛋白
真核基因在原核细胞中表达的一种形式，将 外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的 下游。
质粒的分裂不稳定
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子 代菌的现象。
质粒的结构不稳定
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失 所致工程菌性能的改变。
包含体
是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所 包围，重组蛋白在大肠杆菌中的高表达水平 经常导致蛋白聚集而形成不溶、无活性的包 含体。
➢ 如何获得目的基因 ➢ 基因表达的宿主菌有哪些？ ➢ 真核基因在大肠杆菌中表达的形式? ➢ 酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有那
不大
酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物
哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意
糖基化蛋白
可高产
产物 致癌
基因工程菌应该满足那些条件？
容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原 料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、 适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率 高; 产物容易提取纯化。
➢ 提高质粒稳定性的方法 ➢ 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 ➢ 实现高密度发酵的方法 ➢ 包含体形成的原因 ➢ 包含体的优势。 ➢ 简述菌体生长与能量的关系 ➢ 基因工程药物的质量控制包括那几个方面？ ➢ 基因工程药物怎样保存？
提高质粒稳定性的方法
选择合适的宿主菌 选择合适的载体 选择压力 分阶段控制培养 控制培养条件 固定化
些优点？ ➢ 制备基因工程药物的宿主应该满足那些条件？ ➢ 制备基因工程药物的基本过程 ➢ 质粒不稳定的原因？
酵母细胞作为宿主细胞相对大肠杆菌来说有 那些优点？
表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性
大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 ຫໍສະໝຸດ 易融合蛋白质部分高产
一般 对原核好 对真核差
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
⑴外源基因的拷贝数 ⑵ 外源基因的表达效率 ①启动子的强弱 ②核糖体接合位点的有效性 ③SD序列和起始密码ATG的间距 ④密码子组
成 ⑶表达产物的稳定性 ⑷细胞代谢负荷 ⑸工程菌的培养条件