第十三章 生化药物与基因工程药物分析

㈢高效液相色谱法 • 具有高效分析、灵敏检测、操作简便的 优点 • 分离过程中不破坏分离样品的特点 • 适合于对高沸点、大分子、强极性和热 稳定性差的生物制品的定量分析
1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸
柱：RP—18， 柱温：48℃
流动相：A--0.05% TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）
一、理化分析法
㈠滴定法 • 根据生物制品中某些成分能与标准溶液 定量的发生酸碱中和反应、氧化还原反 应等特性，通过滴定过程而进行生物制 品的含量测定的方法 • 例如：胰酶中胰淀粉酶的测定
• ㈡光谱法 • 生物制品或相关的反应产物的紫外光谱 在某一特征波长处有最大吸收，且一定 的浓度范围内与相应的吸光度成正比， 则可用于生物制品的含量测定 • 例如：比色法测定硫酸软骨素的含量
目的 分离纯化 宿主 产物 细胞 增殖、表达
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二、生物制品的种类和特点
1.疫苗类药物 • 定义： 用病毒或者立克次体接种于动物、 鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而 成
•分类
⑴细菌类疫苗 由有关的细菌、螺旋体或者其衍生 物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组 DNA疫苗、亚单位疫苗等 例如： 人用狂犬疫苗、吸附破伤风疫苗、乙 型脑炎灭活疫苗、乙型脑炎减毒疫苗等
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一、防病、治病的三大药源
化学药物 生化药物 药物 生物药物 中药 生物技术药物 生物制品
biochemical drugs
biopharmaceutics or biopharmaceuticals
biotechnology drugs biological products
1．生化药物：
二、安全性检查
㈠无菌检查 1.基本步骤： • 培养基的制备 • 菌种的选择 • 具体检查 • 结果判断 2.注意事项
㈡热源检查 1.原理 2.检查法 3.结果判断
㈢细菌内毒素的检查 • 凝胶法和光度法，当出现争议时，以凝 胶法为准
㈣异常毒性的检查和特异性毒性检查 1.异常毒性检查 • 生物制品的非特异性毒性的通用安全试 验，检查制品中是否污染外源性毒性物 质以及是否存在意外的不安全因素 • 试验包括小鼠试验和豚鼠试验 • 药典中规定的异常毒性试验，实际上是 一种限度试验
例如:
• 破伤风抗毒素的鉴别 • 人血白蛋白的鉴别 • 重组人白介素-2的鉴别：免疫印记法、 免疫斑点法
2. 生物法：
利用生物体进行试验来鉴别药物。 例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。
利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注
射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥
停止。
第三节 杂质检查
• 一般杂质检查 •特殊杂质检查：原料药纯度分析 生产和贮存过程中杂质的检查 • 安全性检查
梯度洗脱 荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm
测定： 样品---肽 样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2， 110℃，20h ～24h。 样品干燥：真空 样品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/L NaOH 进样测定
2.特异性毒性检查 • 主要检查某些疫苗类生物制品是否存在 自身毒素引起的特异性毒性的不安全因 素 • 一般选择小鼠或豚鼠试验
㈤过敏反应检查 • 将一定量的供试品溶液诸如豚鼠腹腔或 皮内，间隔一定的时间后静脉或皮内注 射供试品进行攻击，观察动物是否出现 过敏反应的情况，以判断供试品是否引 起动物全身的过敏反应 • 过敏反应是检查异性蛋白的试验方法 • 例子
第十三章 生化药物和基因工程药物 分析概念 • 基本要求 • 概述 • 质量检验的基本程 序与方法 • 常用定量分析方法 及其应用 • 练习与思考
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基本要求
1．了解生化药物的定义、生化药物分析 的特点、生化药物分析的进展 2．熟悉生化药物分析的方法 3．掌握常用定量分析方法（酶法、电泳 法、生物检定法、理化法）的基本原理
3.实时定量PCR(Q-PCR)的方法 基于PCR扩增时，在加入一对引物的 同时加入一个特异性的荧光探针，产物 的增加可以通过荧光信号指示，通过实 时监控PCR体系中的荧光信号，对样本 中的初始模板进行定量分析。 通过绘制标准曲线然后推测浓度
㈢产品相关杂质的检查
• 生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏 保存的过程中产生的与产品结构类似的 同系物、异构体、突变物、氧化物、聚 合体和降解产物等。 • 方法有高效液相色谱法和电泳法
3.血液制品
• 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆， 经分离提纯或者重组DNA技术制成的血 浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分， 统称为血液制品 例如： 人血白蛋白、人免疫球蛋白、破伤风 人免疫球蛋白等
4.重组DNA制品
• 采用遗传修饰，将所需的编码DNA通过 一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生 物或细胞系，DNA经过表达翻译后成为 蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制 品制得。 • 宿主细胞：转染载体前的细胞和微生物 • 宿主-载体系统：用于生产过程中两者稳 定的结合
2.基于DNA结合蛋白（threshold）分析系 统 • 基于两种DNA序列非特异性蛋白 -----单链DNA结合蛋白和抗ssDNA的单抗
• 过程
生物素-DNA单链结合蛋白和尿素酶-抗 ssDNA的单抗与变性的宿主细胞DNA结合，形 成复合物； 通过亲和素将这种复合物连接到生物素硝酸纤维素膜； 通过洗涤去除未结合的非特异性蛋白； 最后将生物素-醋酸纤维素膜臵于有尿素 溶液的读数仪，尿素酶催化尿素为NH3和CO2导 致溶液的PH 的变化，读数仪根据此变化推算 出外源性DNA的浓度
动物 植物 微生物
提取 生物-化学半合成 现代生物技术
生命基本物质及 衍生物 降解物 大分子的结构修饰物
例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。
2.生物合成药物
• 由微生物代谢所产生的 • 必须利用微生物及其酶转化反应共同完 成的半合成药物 例：抗生素、生物碱、甾百度文库激素、维生素、 酶及辅酶类药物
3.生物制品
质量检验的基本程序与方法
生化药物和基因药物质量控制的项目：
来源与种类 性状 鉴别 氨酸组分分析 肽图 糖含量 纯度 干燥失重或水分 炽灼残渣 生物活性 热源试验 含量分析
第二节
鉴别试验
理化鉴别法：化学鉴别法
紫外分光光度法 HPLC法 生化鉴别法：酶法 电泳法 生物鉴别法：血清学法 生物学法
一、理化鉴别法
第四节 含量（效价）测定
生化药物和基因药物的含量表示方法： 百分含量：适用于结构明确的小分子药 物或经水解后变成小分子的 药物。 生物效价或酶活力单位：适用于酶类、 蛋白质类药物。
含量测定方法：
理化分析法： 化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色谱法、HPCE法 酶法：酶活力测定法、酶分析法 电泳法 生物检定法
2. 电泳法：以肝素鉴别为例。
O CO O O OH O SO 3 O O HNS O 3 C H2O SO 3 O
与国家肝素标准品对照，其移动位臵相应。
三、生物鉴别法 1.血清学法 体外的抗原抗体试验。 • 经典血清学反应： 凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结 合反应 • 免疫扩散、免疫电泳以及荧光标记、酶 标记等高敏感的检测技术
• • • • • •
细胞因子类：重组人干扰素等 生长因子类：重组人表皮生长因子 激素类：重组人生长激素，重组人胰岛素 酶类：重组链激酶 疫苗：重组乙型肝炎疫苗 单克隆抗体：注射用人T细胞CD3鼠单抗
5. 诊断制品
• 用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫 状态的制品 如：毒素、诊断血清、分群血清、分型血 清等
㈣残余抗生素的检查
• 中国药典（2005年版）三部附录ⅨA抗 生素残留量检查法可以检测残余氨苄西 林或四环素的活性 • 依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的 抑制作用，比较对照品与供试品对接种 的试验产生的抑菌圈的大小，检查供试 品中氨苄西林或四环素的残留量
• 检查方法 • 结果判定 • 注意事项
1.化学鉴别法：
药物 + 试剂 现象 颜色 沉淀
例：溶菌酶 - COiNH- +Cu2+ 色
络合显
2.紫外分光光度法
例：三磷酸腺苷二钠 溶剂：0.01mol/L盐酸 浓度：20μg/ml 判断： λmax：257±1nm A250/A260：0.17～0.27。
3. HPLC法：
利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留 时间和肽图谱的一致性进行鉴别。
酶联免疫吸附法（ELISA）
• 原理 • 试验方法
㈡外源性DNA残留量的检查
• 分子杂交技术 • 基于DNA结合蛋白（threshold）分析系 统 • 实时定量PCR(Q-PCR)的方法
1.分子杂交技术 • 基于DNA探针检测变性而且固定在硝酸 纤维素膜上的宿主细胞DNA。 • 杂交 • 标记探针-地高辛 • 灵敏度是10pg以下
• 以微生物、细胞、动物或人源组织和体 液等为原料运用传统技术或现代生物技 术制成 • 用于人类疾病的预防、治疗和诊断 例如：细菌类疫苗、病毒类疫苗、抗毒素、 抗血清、生长因子、单克隆抗体等
DNA重组技术（基因工程）：生产过程为
天然基因 合成的核 苷酸序列
内切酶 载 连接酶 体
重组 的遗 传物 质
• 体外诊断制品：由特定抗原抗体或有关 生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试 剂盒。 如：伤寒、副伤寒诊断菌液，沙门氏菌诊 断血清，HBsAg酶联免疫诊断试剂盒等 • 体内诊断制品：由变态反应原或抗原材 料制成的免疫诊断试剂 如：卡介菌纯蛋白衍生物等
6.其他制品
• 由有关生物材料或特定方法制成，不属 于以上5类的其他生物制剂，用于治疗 和预防疾病 例如： 胰岛素、胃蛋白酶、核酸制剂等
三、特点
1. 2. 3. 4. 5. 生物体的基本生化成分 分子量大: 分子量测定 结构难确证 全过程的质量控制：原料、生产过程、 最终产品 生物活性检查
6. 7.
安全性检查 效价（含量）测定： 理化法：有效成分的含量 效价测定和酶活力测定：有效成分 的生物活性
四、生物制品的全程质量控制
• • • • 有效成分的同一性、结构确证 有效成分的均一性、纯度检验 有害物质及残余杂质等的控制 高效灵敏的生物活性及比活性等试验方 法
一、特殊杂质的检查
• 生物污染： 微生物污染、细胞成分、培养基成分 • 产品相关杂质 二聚体、多聚体、脱氨或氧化产物、突变 物、错误裂解产物、二硫化物异构体等 • 工艺添加剂 残余抗生素、乙醇、佐剂氢氧化铝等
㈠宿主细胞（菌）蛋白残留量的检查
• 与生物制品生产用的细胞、工程菌相关 的特殊杂质 • 控制异源蛋白的含量以防超量后引起机 体的免疫反应 • 特别对于临床使用中反复多次注射的药 品
2.抗毒素及抗血清的药物
• 凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大 动物所取得的免疫血清叫抗毒素 人体不用自身制造抗体，就可以获得免疫力 例如：破伤风抗毒素、白喉抗毒素等 属于“人工被动免疫”，制剂称为“被动免疫 • 凡用细菌或病毒本身免疫马马或其他大 制剂” 动物所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒 血清 例如：抗五步蛇血清、抗银环蛇毒血清等
二、生化鉴别法 1.酶法：
例：尿激酶的鉴别---气泡上升法
原理：
尿激酶 牛纤维蛋白溶酶原
牛纤维蛋白原
牛凝血酶
蛋白结块
结块溶解： 气泡上升
方法：
取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤 维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原 溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即臵 37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在 30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分 钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐 上升。以0.9%氯化钠作空白，同法 操作，凝结 块在2小时内不溶。
⑵病毒类疫苗 由病毒，立克次体或其衍生物制成的 减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、 亚单位疫苗等 例如： 流感全病毒灭活疫苗、重组乙肝炎 疫苗等
⑶联合疫苗 两种或两种以上疫苗原液按一定的比例配 合制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗 或活疫苗 例如： 伤寒副伤寒甲乙联合疫苗等
⑷双价及多价疫苗 由单一型抗原成分组成的疫苗称为单价疫 苗。由两个或两个以上同一种但不同型 抗原合并组成的含有双价或多价抗原成 分的疫苗，则分别称为双价疫苗和多价 疫苗 例如：双价肾综合征出血热灭活疫苗