脑缺血动物模型与抗脑缺血

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亚低温保护脑的可能机制： 降低脑耗氧量和能量代谢、减少乳酸堆积; 减轻炎性因子的损害; 保护血脑屏障; 减轻脑水肿及降低颅内压等。 因此，实验中应严格控制动物脑实质的温度。
（三）血糖
• 葡萄糖水平可影响脑损伤程度. • 高血糖→缺血后的脑梗死体积↑ →缺血性损 伤↑ 。 • 其机制可能与糖酵解增加，乳酸堆积引起 酸中毒有关。 • 葡萄糖通过酵解可产生2分子丙酮酸，同时 产生2分子ATP。 • 在有氧条件下，丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶 作用下，进行代谢，并在线粒体内经一系 列反应产生CO2和36分子ATP；
（五）鼠种和性别
• MACO后Wistar 大鼠平均梗死体积最小，变 异大； • Sprague-Dawley 大鼠梗死体积稍大，但同 样变异大； • Fisher-344 大鼠梗死体积最大且变异性小; • 高血压大鼠比正常血压大鼠梗死体积大; • 因雌激素对脑缺血具有保护作用，实验中 应全部选择雄性大鼠。
• （1）线栓的选择 • 线栓的选择直接关系着造模的成功与否。 一般选择为外科尼龙线，直径有3-0、4-0 两种。但许多学者在实验中发现，运用 0.20～0.26 mm 的进口鱼线代替4-0 外科 手术线，由于其韧性好，硬度也较佳，进 线时较4-0 手术线顺利，有利于模型的制 备，且较经济。
• 由于直径和线质量硬度的不同而导致梗塞 灶部位和体积的变化。 • 一般来说，选择标准是不能太硬，这样很 容易刺破血管造成蛛网膜下腔出血； • 也不能太软，当线栓进入大脑前动脉时能 感到阻力，也就是再插线会见到线弯曲， 太软则弯曲不明显。 • 在选择使用鱼线时，最好用细砂纸打磨头 端，并将头端沾蜡5mm左右，造模成功率较 高。
• 但在缺血缺氧时，丙酮酸脱氢酶活性受抑制，此 时丙酮酸则在乳酸脱氢酶作用下产生乳酸，局部 脑组织PH下降。 • 因此，当葡萄糖由有氧氧化转化为无氧酵解时， 不但使能量产生减少，还可引起脑组织局部环境 酸度增加。 • 脑缺血后，由于脑血流的减少，葡萄糖供应的减 少可能会限制乳酸的产生量。 • 如果此时增加葡萄糖的血浆浓度，大量糖就会通 过酵解产生乳酸，从而加重酸中毒。 • 因此控制血糖水平对模型的损伤程度也非常重要。 • 可在模型制作之前，动物统一禁食12h。
图2 TTC染色：正常脑组织为深红色，梗死区 为灰白色
（二）神经机能学评价
• 1、行为学评价 • 多采用Longa评分。 • Longa 的神经功能缺损5分制标准为： • 0分：无神经系统功能缺损症状，活动正常； • 1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现 为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁（图3）； • 2分：爬行时出现向非手术侧转圈（追尾现 象）； • 3分：行走时身体向偏瘫侧倾倒； • 4分：不能自发行走，意识丧失。
• （2）线栓插入深度 • 线栓插入的深度是模型成功的关键环节。 • 插入过深会剌破颅内动脉造成蛛网膜下腔出 血； • 过浅则达不到阻塞MCA的位臵。 • 很多报道指出深度与动物的体重等情况相关。 • 目前对于线栓进入深度较为统一的意见是从 颈外动脉起始处计18.5±0.5mm。 • 如果线栓进入的长度明显小于17mm 时，则 会导致造模失败，影响实验结果和可靠性。
2、线栓的插入 • 颈外动脉切口插入法：
• 此种方法可以用来制备脑缺血、脑缺血再 灌注模型。 • 由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎 并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲 状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断 颈外动脉使其主干游离备用。 • 然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根 部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。
• 将大鼠仰卧位固定，分离双侧颈总动脉。 • 大鼠清醒状态下用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉，可 见大鼠意识和翻正反射消失，眼变白，竖毛，呼吸 加快。 • 30min后去除动脉夹，造成再灌注模型。 • 再灌同时股静脉注射60mg/kg伊文思蓝。60min后大 鼠断头取脑，然后用生理盐水和丙酮混合液（3： 7v/v）制成10%匀浆（W/V）。 • 离心，取上清液，在620nm处测吸光度表示脑组织 中伊文思蓝含量，以此反映受试药对脑血管通透性 的影响。
图3 Longa神经行为评分（1分）
2、脑电图观察
• 局灶性脑缺血会引起脑电 波的抑制，缺血区脑电图 出现波幅降低，频率减慢.
五、实验性脑缺血损伤的影响因素
• 多数麻醉药可影响动物的呼吸，引起高碳酸血症， 酸中毒，并可降低血压，对缺血性脑损伤程度有 直接影响，因此，麻醉药的种类、剂量、给药途 径等因素均影响模型的制备。 • 国内实验多采用腹腔注射麻醉。 • 常用的麻醉药中，苯巴比妥钠对体温和呼吸的影 响最大，水合氯醛和乌拉坦次之，戊巴比妥钠相 对较小。 • 此外，氯胺酮和甲苯噻嗪腹腔注射麻醉也会对动 物的呼吸、心率等造成明显影响。
1、线栓的制备
• 在制备大鼠MCAO模型的过程中，线栓的制备颇为 重要。 • 将线分别截成50mm左右线栓，在前20mm用记号笔 抹上颜色以作进入颅内血管深度的标记，并将线 栓制备好后臵肝素生理盐水中备用。 • 线栓的制备主要有两种方法： • Koizumi 将栓线的前段5mm 左右的部分涂上硅树 脂，使其变粗，变硬，直径达0.25～0.3 mm，以 利于进线和阻断血流； • Longa 法是将栓线的头端烧成小的圆头，直径稍 大于线栓的直径。
脑缺血动物模型
脑缺血动物模型
• 动物模型是医学药学研究中的一个重要手 段，尤其对于缺血性脑血管病，能即刻制 造或模拟血流下降或阻断，只有利用动物 模型才能进行。 • 动物模型具有方便、快捷、条件可控、脑 缺血程度一致等优点。 • 近年来，脑缺血的研究进展有利于各种动 物模型的广泛应用。
• 建立和选择理想的缺血性脑损伤动物模型， 对于缺血性脑血管病研究具有重要意义。 脑缺血动物模型对以下研究具有很重要的 实际应用价值: • (1)不同脑缺血状态下的病理学改变； • (2)缺血半暗带的研究； • (3)再灌注损伤； • (4)缺血本身导致的病理生理学变化； • (5)干预治疗对缺血性损害的保护作用； • (6)缺血性损害的部分机制等。
脑缺血动物模型的分类
• 各种动物模型具有不同的特点，因此应根据不同的 研究目的选择最适宜的动物模型。 • 根据动物种类分类： • 可分为猴、狗、大鼠、小鼠等脑缺血模型。 • 其中啮齿类动物因价格便宜、来源充足、制作模型 方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理特点与人 接近，被广泛用作脑缺血及缺血再灌注模型； • 根据缺血范围分类：又可分为全脑缺血和局灶性缺 血两种。 • 现将常见的脑缺血动物模型概述如下：
线栓法(thread embolism method)
• 线栓法：是目前国内外学者制备MCAO动物 模型最常用的方法。 • 该方法是Koizumi于1986年发明的。 • 在1989年，Longa对这种方法加以改进，而 后广泛用于实验性脑缺血研究。 • 目前在脑缺血实验中多采用Longa改进的线 栓法。
3、线栓法制备动物模型的影响因素
• 栓线法大鼠MCAO模型在国际上已被广泛采 用。 • 但仍有很多因素可影响该模型缺血程度的 稳定，如动物体重、栓线的直径及插入深 度、肝素的使用等，会遇到有的动物无脑 缺血症状或症状很轻，有的动物症状很重 或死亡。 • 因此，必须充分考虑建立模型过程中的影 响因素。
二、局灶性脑缺血动物模型(Focal cerebral ischemia models)
• 由于大脑中动脉（middle cerebral artery， MCA）是脑卒中的多发部位，因 此大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO) 模型被认为是 一种较理想的动物模型。 • 阻断MCA 的方法主要有开颅法、线栓法以 及栓塞法。 • 最常用的是线栓法
一、全脑缺血模型(Global cerebral ischemia models)
• 全脑缺血模型是完全阻断或骤然降低大 脑的血流，造成全脑缺血。 • 近年来利用啮齿类动物复制全脑缺血模型， 在缺血性脑损伤的研究中较为广泛。共同 特点：缺血暂时广泛地影响各个脑区，但 病理改变发生在易损区。
大鼠四血管阻断模型[The Four-Vessel Occlusion (4VO) Model in the Rat]
• 水合氯醛以其体内代谢产物三氯乙 醇发挥麻醉作用，对呼吸抑制作用 较其它中枢麻醉药小，大剂量可引 起呼吸和心血管系统抑制，引起血 压降低和酸中毒。 • 其镇痛作用较弱。 • 实验中多采用3%水合氯醛 (300mg/kg)进行麻醉。
（二）脑温
• 实验中温度过高或过低均会影响神经 细胞损伤。 • 脑温下降2～3℃对缺血性脑损伤，尤 其皮质损伤具有明显的保护作用。 • 亚低温均可抑制脑缺血损伤. • 在缺血期低温必须持续1 ～2 h才能起 到保护作用，持续时间<30min则无效。
• 将尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈 内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处 为标记，推进18mm 左右时感到阻力，即到 达了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA 的 所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。 • 在一定时间后拔出尼龙线，扎紧动脉残端， 即可实现MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。
图1 大鼠颅底内外血管（部大鼠体重指标为250-330g。 • 要确保所使用线栓能够阻塞实验动物的 MCA ； • 手术前应禁食过夜，避免大鼠血糖不稳定； • 麻醉剂用量对手术的影响。
五、缺血性脑损伤的评价方法
• 在局灶性脑缺血动物模型中，常用的评价 缺血损伤的方法有以下几种。 • （一）形态学评价 • 1、光镜观察 • 将脑组织染色后放在光学显微镜下观察， 可以看到脑缺血后神经元肿胀、轮廓不清、 空泡样变性及核固缩等一系列病理形态学 变化， 从而对缺血损害做出评价。 •
• 大鼠四脑动脉阻塞模型：双侧椎动脉和双侧颈总 动脉阻断。 • 用3％水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip.）。 • 然后于枕骨下作1cm左右切口，暴露第一颈椎左右 两个横突孔，以1411高频小电刀插入横突孔烫闭 双侧椎动脉。 • 24h后乙醚麻醉状态下切开颅顶皮肤，于矢状缝与 冠状缝相交及颞骨与人字缝相交处分别埋植脑电 极，接于SJ-42多导生理记录仪，以在实验过程中 记录大鼠的脑电图（EEG）及翻正反射恢复时间。
TTC染色的方法：
• 大鼠迅速断头、取脑，-20℃冷冻约15 min 。 • 待其稍变硬时，从冰箱取出，用切片机将两 侧大脑半球切成厚1.5 mm的冠状切片，浸泡 于10 ml 1%的TTC磷酸缓冲液中。 • 37℃避光孵育约15 min，此间将脑片的上下 面翻转至少一次，以便两面染色一致。 • 正常脑组织染为深红色，脑梗死区不染色 （灰白色）。
2、电镜观察
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电镜下可看到缺血神经 元线粒体肿胀，嵴崩解， 内质网池扩张变形，粗面 内质网脱颗粒等结构改变。
3、TTC染色
• 采用氯化三苯基四氮唑 ( triphenyltetrazolium chloride，TTC) 对脑组织染色，其原理是TTC和活细胞线粒 体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的 triphenylformazan（TTF），用来表示细胞 的活力。 • 结合图像分析技术观测梗塞范围。 • 通过测量梗塞体积来衡量脑缺血的严重程度。 • 是评价脑缺血损伤常用的指标。
（四）血压和血气
• 血压对脑梗死模型有一定影响，高血压的动物缺 血改变出现早，而全身低血压也会加重脑损伤， • 因此，实验应常规监测平均动脉压。 • 脑缺血时，血气对损伤程度也有较大影响，高碳 酸血症和酸中毒明显增加脑梗死体积。 • 模型制作时，应抽取血样进行血气分析，测定动 脉血氧，二氧化碳分压，氧饱和度和血液酸度。 • 麻醉时配合人工呼吸可维持较稳定的血气指标， 使对实验结果更好进行判断。
• 优点： • ①可产生严重的脑缺血。可较好地模拟临床上多种 原因造成的全脑缺血性损伤过程； • ②缺血一定时间后可按实验要求重新开启动脉夹进 行再灌注。 • 缺点： • ①成功率低，约50%； • ②操作相对复杂、不能一次完成，动物的死亡率高。 该方法适合于脑缺血的急性实验研究，现仍被 广泛应用。