线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的制备

线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究
马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1
（1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；）
摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。

②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。

本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。

最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。

③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。

关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法
Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture
Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1
(1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious.
Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture
脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。

早在1986年，日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。

1995年，我国也出现了相关的报道。

目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。

国内一些学者对此方法又进行了改进，但仍存在一些问题，例如：手术操作过程复杂，实验动物死亡率较高，而模型成功率较低，并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点，就是对该模型的制作过程描述得过于简单，读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。

本文旨在前人研究的基础上，建立一种操作简单，成功率高的 MCAO再灌注模型，并将此方法图文并茂的展现给读者，使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。

1 材料与方法
1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体重280-320g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

随机分为模型组和假手术组，每组20只。

四氮唑红(TTC)染料，由沈阳市博尔美试剂公司提供。

1.2 栓塞线的制备栓塞线采用
2.5号钓鱼线，直径0.25-0.28mm。

将其剪成4cm长，一端用细砂纸打磨成半球形（需在显微镜下筛选），再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm
和2.2cm处作好标记，以便在手术时随时判断栓塞线插入深度。

1.3 大鼠脑缺血模型的制作在室温 (22 ℃) 条件下 ,大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定于手术台上,颈部用碘伏消毒后正中偏右0.5cm处纵向切开2cm 切口,分离右侧颈总动脉(CCA) 、颈外动脉 (ECA) 、颈内动脉 (ICA) （如图一）。

其中ECA 需暴露出3-5mm, ICA需分离至翼腭动脉。

在ECA远端距CCA分叉处3-5mm处结扎ECA（如图二），注意：结扎用的手术线不要剪断。

再用电凝器在结扎点远心端电凝ECA，用眼科手术剪在结扎点和电凝点之间剪断ECA。

然后将ECA向鼠尾方向牵拉，使ECA和 ICA成一条直线。

动脉夹夹闭 CCA 近心端和ICA远心端,在ECA结扎点前端剪一“V”形小口（如图三）,缓慢将栓塞线经ECA插入ICA，打开ICA远心端的动脉夹。

根据栓塞线上的标记，判断栓塞线插入的深度。

当CCA分叉进入栓塞线1.8cm至
2.2cm标记之间区域时，插线力度一定要轻，稍感阻力立即停止向前插线。

在“V”形切口近心端结扎ECA，使栓塞线和ECA固定在一起。

剪断各结扎点上的手术线，逐层缝合，将栓塞线多余的部分缝合在创口之间，暴露于皮外。

1.4 假手术模型的制备假手术组手术方式同模型组，但不做栓塞，仅暴露出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，然后逐层缝合即可。

1.5再灌注的时间及方法再灌注时间点的选择十分重要，时间过短，神经功能缺失体征不明显；时间过长，脑组织缺血过于严重，失去治疗意义。

经过多次试验和文献支撑，我们认为栓塞2小时后进行再灌注不仅神经功能缺失体征明显，TTC染色显示脑组织坏死程度适中，而且如果能进行有效治疗，可以得到满意的治疗效果。

再灌注的具体方法是将缝合线打开，完全暴露栓塞线，用眼科镊子固定结扎点，将栓塞线缓慢抽出，直至栓塞线上的0.6cm处标记点暴露出来为止，剪掉栓塞线多余部分，逐层缝合创口。

1.6 神经功能缺失体征评分参考 Longa及Bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分。

0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走,意识丧失。

分值越高 ,说明动物行为障碍越严重。

1.7 四氮唑红染色大鼠缺血2h再灌注24h后立即断头取脑,以2%TTC常规染色,4%多聚甲醛固定保存。

2 结果
2.1 术中意外死亡率模型组20只大鼠中，意外死亡5只，其中术中死亡2只，术后24小时内死亡3只，总死亡率25%；假手术组无死亡。

死亡的5只大鼠中，经脑组织TTC染色证实，有2只因右侧大脑大面积梗死致死，另外3只大脑无缺血表现，分析原因可能因为麻醉程度过深致死。

2.2 神经功能评分模型组为2.65±0.8127，假手术组3只评为1分，其余均为0分。

图为被评为3分和1分的模型组大鼠。

被评为3分的模型大鼠被评为1分的模型大鼠
2.3 脑组织TTC染色模型组剩余的15只大鼠脑组织经2%TTC染色后发现，右侧脑组织均有不同程度的缺血坏死灶，大小不一，位置在额、顶叶皮层居多，也有的在颞叶和新纹状体外侧部出现坏死。

图为模型组两只大鼠的脑组织TTC染色照片。

不同梗死程度大鼠的脑组织TTC染色
3 讨论
近年来，对大鼠脑缺血再灌注的动物模型研究很多，已建立多种制作方法 ,前人已摸索出的光化学诱导MCA血栓形成或经颞下电凝MCA的方法[2]，因创伤大 ,且不能够进行再灌注等缺点,不适合于人类脑梗死后血管再通方面的研究。

线栓法建立的大鼠局灶性脑缺血再灌注模型不需开颅,创伤小,不影响缺血性脑病病理变化的自然过程,而且操作简单,MCA闭塞效果好,可准确控制缺血及再灌注时间,是目前局灶性脑缺血及再灌注损伤研究较为理想的模型。

模型制作过程中需要注意以下几个问题：（1）大鼠的麻醉。

麻醉程度要适中，过浅会影响手术过程的操作，过深会导致大鼠在术中的死亡。

但大鼠自身也有一定的差异性，有些会对麻醉药反映过于敏感，标准剂量也会致死，而有些对麻醉药有一定的耐药性，后一种情况较为好处理，可以在术前依据具体情况酌情追加一定量的麻醉药。

但特殊情况必定是少数的。

（2）术中血管的分离。

在分离右侧CCA、ECA、ICA时，要特别注意迷走神经的保护，一般用玻璃分针分离血管，可以减少对迷走神经的损伤，尽量避免对迷走神经的直接牵拉。

（3）术中大鼠状态的观察。

手术时，要密切观察大鼠的状态，如发现呼吸异常，可用镊子将大鼠舌体牵向口角一侧，防止舌根阻塞呼吸道窒息而死。

（4）手术视野的处理。

为了在手术时能有一个清晰的视野，可以自制一些金属钩，连接上橡皮筋，将切口向左右拉开，尽量扩大视野。

（5）栓塞线的处理。

栓塞线是模型成败的关键，栓塞线一般选用钓鱼线，可根据大鼠的体重来选择型号，300g左右的大鼠可以选择2.5号（直径0.25-0.28mm）的钓鱼线，以此为准上下稍作浮动来选择。

钓鱼线的打磨十分重要，由于用剪刀剪断钓鱼线时断端过于锐利，如不做处理，在插线过程中很可能将动脉壁戳穿而导致失败，因此要用细砂纸将断端打磨圆滑，也有文献报道用酒精灯将断端烧成球形的，但烧成球形的头部直径无法控制，容易导致实验的失败。

另外，在栓塞线上作标记是明确栓塞深浅的最好办法，不用模糊的判断是否已经栓塞到位，这也给模型的成功提供了保障。

（6）栓塞线插入方向的调整。

在插入栓塞线时，
有时栓塞线只进入了1cm左右就遇到了阻力，这种情况多数都是由于栓塞线误入了翼腭动脉而至。

解决办法有二，对于操作手法较好的实验者来说，可以将ICA继续向前分离，充分暴露出翼腭动脉，用眼科镊子对栓塞线的方向作以纠正；而无法将ICA继续进行分离的实验者可以通过改变ECA断端方向的方法来调整栓塞线的方向而使栓塞线顺利进入ICA，这也是此种手术方式的优势所在。

参考文献：
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