线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备方法pdf

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备前言相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。

为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。

第一部分线栓模型制备理论及经验⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。

该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。

从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。

此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。

1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。

1997 年 Hara等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。

此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。

国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。

线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。

控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。

但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。

②动物品系、体重、批次会影响结果。

动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。

③操作者的科研训练影响结果。

严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。

④血管破裂出血。

操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。

轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。

2 大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置3 大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（来自zhuqing0506战友）本人现在正在做线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型），这方面的资料我查了一些，这个实验我也作了一段时间，不敢说很专业了，不过现在基本上我能在15min左右完成手术，而且手术过程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。

虽然前面有很多前辈发了很多MCAO的很专业的贴子，不过我觉得比较凌乱，现在我把我的心得体会和以前的贴子的精华部分奉献给大家，希望这会对将要做这个实验的朋友有一丝的帮助。

虽然做实验总会有郁闷的时候，不过风雨之后总会见到彩虹的，这可以也是我的心得体会。

衷心祝福大家能把实验做的成功、完美！！！！实验前准备麻醉剂：水合氯醛（应较好的控制大鼠体温）保温：60W白炙灯高度为37cm直接照射能使肛温保持在37℃ 栓线的制备：1.取熔点为 56℃的固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化。

直径为 o．24mm、长 5cm 的鱼线一端5mm长的一段，垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面，其直径为0.26mm。

就这样，普通的鱼线即可变成规相一致头端光滑圆钝的栓线。

2.在鱼线 18mm 的位置用涂改液标记一个白色点。

TTC 的配制：用 0.2mol/L 磷酸缓冲液（PBS）配成 2%TTC 溶液（pH7.5）,避光保存。

体重与栓线直径：线栓直径0.24mm采用的SD大鼠，体重250-300g。

实验方法：动物用10％水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。

仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。

用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。

然后在距 CCA 分叉部 4mm 处剪一小口，将拴线插入到 ICA，这时用绕在 CCA 远心端的细线轻轻系牢拴线。

（不可过紧，否则近线困难，但松了又会出血。

）用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18 mm时（一定要将血管放松至原来状态,且保证标记点在分叉处,由于标记的是白色的所以很容易看的），紧紧系牢CCA远心端的细线，此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。

血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。

缝合伤口，单笼饲养观察。

如果需要再灌的话，就把拴线抽出即可，因为脑底有个动脉环，结扎一侧颈总动脉大脑不会缺血的。

注意事项：1．分离时要层次清楚：正中剪开 SD 大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。

下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。

见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。

2.分离血管时，要尽量将血管剥离的干净些，这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜（误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪断了，要注意口子越小越好插线），且要剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。

当然，切勿牵拉过猛，以免使血管发生痉挛，导致栓线不能顺利进入。

3.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。

4.如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。

5.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。

因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。

这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方,可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力,要不血管就要破了6.栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的7.进线时，使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

8. 术后一定要注意保暖。

9. 插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。

10．手术后评分的主观因素很大，有用4 分制和11 分制的，我个人认为用4 分制比较准些。

其标准是：0 分，无神经损伤症状; 1 分，手术对侧前指不能完全伸展；2 分，向手术对侧行走；3 分，大鼠成追尾状运动。

11. 性激素对脑梗死面积有较大影响，应采用单一性别的动物进行实验。

舍去标准：⑴栓线插入深度不足18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠⑵蛛网膜下腔出血、MCA 起始部或其附近的willis 环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion 损伤。

3）手术时出血较多，症状很重的动物。

死亡原因分析：首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。

附带的其他说明：1..线拴法存在一定的死亡率。

对于这情况我感觉比较头疼，也希望高手指点。

2. 模型成功率和评价指标是相关联的矛盾，手术后可根据动物的表现加以评分，确定模型是否成功，模型成功与否会对结果的评价带来影响。

有可能你模型没成功，结果判断为是药物的作用效果。

所以对手术后模型是否成功应该进行筛选的。

另一方面，如果你做了预防给药，药效的作用也容易被认为是模型不成功，这也需要后边进行脑组织染色和组织血检查进行验证。

脑组织检查时可剔除模型不成功以及SAH 的个例。

故实验在手术后要进行行为学评分，试验结束时应对脑组织进行组织学检查或染色。

TTC 染色是采用的宏观标本染色，确定梗死面积可采用体积法或面积法，但最好用扫描仪将脑组织切片进行扫描，选择合适的软件统计梗死面积。

3.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h 基本趋于稳定4. 整个试验是很费动物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。

5. 除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.6．在颈内和颈外之间常常会有一个交通支，其位置也不太相同，一定要万分小心，我曾经因为不知有这个交通支而勿将其破坏，导致大鼠出血不止！4 也谈大鼠MCAO 模型的实验体会（来自bladeflyer 战友）我的课题是关于某药物对缺血性神经疾病的保护作用研究，因此对于动物脑缺血模型尤其是MCAO 模型的制作不得不熟练掌握，于是有了大量郁闷的摸索与重复劳动，也有关于它的提高与体会，虽然前面有很多前辈对于MCAO 的贴子已经很专业了，但我想也许自己也能有此微弱的闪光让后面的朋友们感到少许光明和温暖，哪怕只是一个愿望，呵呵！关于大脑中动脉缺血模型，目前文献能查到的有三种制作方法，应用手术的方法和颈内动脉注射ET-1 的方法都不如线栓法流行，而我自己的实验也证明线栓法制作MCAO 是效果稳定并可行的。

下面谈谈我自己的一些体会，一家之言仅供参考：一）关于实验大鼠的选择：前面我曾查到一篇贴子谈到了大鼠种系选择，而我自己作过wester 鼠和SD 大鼠，感觉从解剖层次上看品系上差别并不是太大，或者说对于造模的影响还不如大鼠体重的选择。