细胞冷冻保存方法、复苏经验总结
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
细胞冻存（缓存）
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可
吹打脱落。
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。
（冻存细胞程
序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为
宜。
）
细胞复苏（速溶）
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。
根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
计算存活率
取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％。
细胞复苏总结报告范文(3篇)
第1篇一、前言细胞复苏是细胞培养过程中的重要环节，它关系到细胞培养的成败。
细胞复苏是指将冷冻保存的细胞从冷冻状态恢复到活细胞状态的过程。
本报告旨在总结细胞复苏过程中的经验教训，为今后的细胞培养工作提供参考。
二、实验目的1. 掌握细胞复苏的基本原理和方法。
2. 提高细胞复苏成功率，保证细胞活力。
3. 分析影响细胞复苏的因素，为细胞培养提供理论依据。
三、实验材料1. 冷冻保存的细胞：细胞种类、冻存时间、冻存液等。
2. 解冻设备：水浴锅、冰盒等。
3. 培养基：DMEM、胎牛血清等。
4. 工具：移液枪、吸管、细胞培养皿等。
四、实验方法1. 解冻：将冷冻保存的细胞从冻存管中取出，放入37℃水浴锅中解冻，解冻时间约为2-3分钟。
2. 洗涤：将解冻后的细胞用预热的DMEM培养基洗涤2-3次，以去除冻存液中的保护剂。
3. 添加培养基：将洗涤后的细胞转移至细胞培养皿中，加入适量的DMEM培养基。
4. 培养：将细胞培养皿放入细胞培养箱中，在适宜的条件下培养，观察细胞生长情况。
五、实验结果与分析1. 细胞复苏成功率：经过多次实验，细胞复苏成功率在90%以上，说明本实验方法基本可行。
2. 细胞活力：复苏后的细胞活力较好，细胞形态饱满，生长旺盛。
3. 影响细胞复苏的因素：a. 解冻速度：解冻速度过快会导致细胞损伤，解冻速度过慢会导致细胞复苏不完全。
本实验采用37℃水浴锅解冻，效果较好。
b. 洗涤次数：洗涤次数过多会导致细胞活力下降，洗涤次数过少会导致残留保护剂影响细胞生长。
本实验洗涤2-3次，效果较好。
c. 培养基：适宜的培养基有助于细胞生长，本实验使用DMEM培养基，效果较好。
d. 温度：适宜的温度有助于细胞生长，本实验在细胞培养箱中培养，温度控制在37℃左右，效果较好。
六、结论1. 本实验成功掌握了细胞复苏的基本原理和方法，提高了细胞复苏成功率。
2. 通过分析影响细胞复苏的因素，为今后的细胞培养工作提供了理论依据。
3. 在细胞复苏过程中，应注意解冻速度、洗涤次数、培养基和温度等因素，以保证细胞复苏效果。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
冻存细胞复苏步骤
冻存细胞复苏步骤冻存细胞复苏是一种常用的细胞保存方法，它可以将细胞冷冻保存在极低温度下，以防止其失活或死亡。
当需要使用这些冻存细胞时，我们需要进行复苏步骤，使其恢复到正常的生活状态。
下面将介绍冻存细胞复苏的步骤。
第一步：预备工作在进行细胞复苏之前，我们需要做一些预备工作。
首先，准备好培养皿和培养基。
培养皿应该是无菌的，以确保细胞复苏的成功。
培养基应该是适合细胞生长的，可以提供必需的营养物质和生长因子。
其次，准备好所需的实验器材和试剂。
第二步：取出冻存细胞将冻存细胞保存管从液氮罐中取出，迅速将其放入37摄氏度的水浴中。
在水浴中加热的过程中，可以轻轻摇晃管子，以加快冻存细胞的解冻速度。
当冻存细胞完全解冻后，将其转移到无菌的培养皿中。
第三步：培养细胞将解冻后的细胞转移到培养皿中后，加入预先准备好的培养基。
培养基应该是预热的，温度应与细胞生长温度相适应。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。
同时，确保培养基中的氧气和二氧化碳浓度适当。
第四步：观察细胞生长在细胞复苏的过程中，我们需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态和数量变化，判断细胞是否成功复苏。
如果细胞开始生长并形成典型的细胞群落，说明细胞复苏成功。
第五步：细胞传代当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞传代，以维持细胞的正常生长和功能。
细胞传代是将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，以减少细胞密度，防止细胞过度生长。
传代的时机应该根据细胞的生长速度和培养皿的容量来确定。
细胞复苏是一项关键的实验操作，它可以使冻存的细胞重新恢复到正常的生长状态。
通过合理的操作步骤和严格的操作要求，可以提高细胞复苏的成功率。
在进行细胞复苏时，我们需要注意操作的无菌性、培养基的配制和温度的控制等因素，以确保细胞复苏的顺利进行。
同时，及时观察细胞的生长情况，并进行适当的细胞传代，可以保持细胞的正常生长和功能。
冻存细胞复苏是一个复杂而重要的过程。
只有严格按照操作步骤进行，并注意细节和细胞的特性，才能够成功复苏冻存的细胞。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤细胞冻存和复苏听起来像是高深的科学术语，其实说白了，就像把细胞装进冰箱里暂时“冷藏”，然后再拿出来“解冻”一样。
这样做的目的，是为了保存细胞的活性和功能，方便未来的研究或治疗。
那具体怎么操作呢？来，我给你一步步拆解这门科学。
1. 细胞冻存1.1 准备工作首先，你得确保你手头有一切所需的材料。
想象一下，你要出门旅行，得先把行李打包好对吧？冻存细胞也是一样，你需要准备冻存管、冻存液（通常是含有二甲基亚砜（DMSO）的冻存液）、冷冻设备等。
1.2 细胞收集接下来就是收集细胞了。
像是在收集宝贵的珍珠一样，你要小心翼翼地操作。
取出细胞时，要确保培养基是温暖的，细胞在里面像小鱼在水中一样舒适。
把细胞离心后，用吸管轻轻地取出细胞沉淀物，别弄成一团糟。
此时，你的细胞就像小小的珍宝，正准备“打包”进冻存管。
1.3 冻存液准备冻存液的准备很重要。
通常，冻存液里含有二甲基亚砜（DMSO），它能帮助保护细胞免受冷冻过程中冰晶形成的伤害。
用时，一般是按照比例混合好，倒入已经准备好的细胞悬液中，搅拌均匀。
这就像是给你的细胞穿上一件防寒大衣，确保它们在寒冷的“冰箱”里不会感冒。
1.4 冻存过程好了，液体准备好了，接下来就要将细胞放入冻存管中，然后开始冷冻过程了。
细胞冻存管要放进预冷的冰箱里，逐渐降温。
这时候，温度得降得非常缓慢，不能急功近利。
通常，我们会在80°C的冰箱里慢慢降温，直到彻底冻住。
记住，冷冻过程就像等待一锅慢炖汤，急不得。
2. 细胞复苏2.1 取出冻存管当你需要使用冻存的细胞时，首先要把冻存管从冷冻设备里拿出来。
这个步骤就像你从冰箱里拿出刚冷藏好的冰淇淋。
速度要快，不然细胞受热时间过长，可能会损失活性。
拿出来后，立刻放入37°C的水浴中，快速解冻。
2.2 解冻解冻的时候，就像把冰淇淋从冰箱里拿出来放在桌上，过一会儿就开始变得柔软。
细胞的冻存管要在水浴中不断摇晃，确保液体均匀加热。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
干细胞冻存及复苏步骤
干细胞冻存及复苏步骤
一、干细胞冻存及复苏步骤
1.提取干细胞
(1)首先，从捐赠者身体组织中提取干细胞，比如从头发根部提取毛发内的细胞，或从脐带血中提取干细胞。
(2)使用双曲线增殖诱导方法，通过对提取的干细胞进行双曲线增殖诱导，使其变成能够细胞分裂的干细胞。
2.干细胞细胞系建立
细胞分裂时，可以分离出更多干细胞，将这些干细胞细胞分离出来，再放入相应的培养基中，建立起细胞系。
3.干细胞冻存
(1)在细胞分离时，应当尽快进行冻存，以防止细胞活性下降。
(2)将细胞放入冰淇淋箱，将其温度降至-80℃，然后将其冻存，一般可以保存2-3年。
(3)将细胞放入低温液氮坩埚中冻存，可以保存更久，约10年。
4.干细胞复苏
(1)将细胞从低温冰箱中取出，将其温度升至4℃，然后将其放入相应的培养基中，缓慢地升温，使其复苏。
(2)缓慢地加入相应的培养液，适当的调节成分，使其复苏，并且保持活性。
(3)观察复苏的细胞，观察其繁殖情况，确保细胞复苏的质量。
5.细胞发展
(1)可以使用双曲线增殖诱导方法，结合培养基中的生长因子，诱导细胞进行分化，用于后续的发展。
细胞冻存和复苏的基本原则
细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。
想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。
1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。
这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。
要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。
对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。
1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。
市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。
这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。
用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。
你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。
1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。
这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。
通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。
记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。
2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。
复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。
2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。
这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。
解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞复苏的操作方法
细胞复苏的操作方法
细胞复苏是指将处于悬浮状态或冷冻保存状态的细胞，通过适当的处理方法，使其重新恢复到正常生长状态并继续进行繁殖和生长。
具体的操作方法如下：
1. 取出冷冻存储的细胞：将处于液氮存储罐内的细胞冷冻管快速放入预先准备好的70%乙醇中消毒，待消毒10秒后，取出放在无菌条件下的台面上。
2. 进行解冻处理：将细胞冷冻管立即放入预先准备好温水中，以室温解冻，每隔2-3分钟轻微摇晃管子，直到解冻完全，再立即将管子放到孵化箱内，避免冷冻时产生的压力冲击细胞，引起溶胞现象。
3. 处理细胞培养基：细胞培养基的PH值、温度、CO2浓度等条件需要顺应细胞情况逐渐恢复到正常生长状态，避免环境突变影响细胞的复苏和生长。
4. 加入细胞：将已解冻的细胞迅速转移到培养基中，先进行暴露5~10分钟，再进行转移至预处理好的细胞培养瓶中，尽可能使细胞均匀分散。
5. 稳定恢复期：转移后，避免环境的干扰干扰细胞的恢复稳定，维持细胞培养瓶内的清洁卫生环境，逐渐调节细胞培养的温度和CO2浓度，让其适应细胞定植状态，并逐渐达到正常的生长状态。
6. 定期观察：对于细胞进行定期观察，观察细胞的颜色、形态、大小等，以及
细胞繁殖情况、存活率等指标。
同时，还要注意细胞培养瓶内的清洁卫生环境，保证细胞的稳定生长和繁殖。
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。
确保细胞在保存前是健康和活跃的。
2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。
3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。
4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。
常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。
5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。
6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。
二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。
培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。
2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。
3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。
4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。
6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。
1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。
2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。
通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。
3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。
例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。
4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。
液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。
细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、慢冻程序1、标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。
3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法1、预先配制冻存液10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
液氮长期保存五、保存细胞的复苏方法1、快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则
1.保护细胞膜：细胞膜是细胞内部和外部环境之间的重要屏障，保护
细胞膜是冻存和复苏的关键。
冻存前，必须将细胞放入适当的保护剂中，
例如甘油、DMSO等，保护细胞膜免受冷冻过程中的损伤。
在复苏过程中，使用适当的解冻缓冲液缓慢地回温，避免细胞膜急剧收缩或破裂。
2. 控制冷冻速度：细胞冷冻的速度必须缓慢，以避免冻结引起的细
胞破坏。
最佳的冷冻速度取决于细胞类型和冷冻条件，通常应在-
1°C/min以下。
可以使用特殊的冷冻器进行控制，或通过降低温度梯度
来减缓细胞的冷冻速度。
3.恢复培养环境：在冻存的细胞复苏过程中，必须立即将细胞恢复到
培养环境中。
这包括向培养基中添加适当的营养物，例如葡萄糖、氨基酸、维生素等，在适宜的温度、氧气和二氧化碳条件下培养。
4.检测细胞的活力和质量：冷冻和复苏过程都会对细胞产生损伤，因
此必须定期检测细胞的活力和质量。
这可以通过测量细胞增殖率、形态、
细胞周期及细胞凋亡等生化和形态指标来评估。
总之，一个成功的细胞冻存和复苏过程需要考虑多个因素，包括保护
细胞膜、控制冷冻速度、恢复培养环境和检测细胞活力和质量。
只有通过
精心设计和执行这些步骤，才能最大限度地减小细胞冻存和复苏过程中的
损伤和质量损失。
细胞冻存与复苏要点与注意事项
细胞冻存与复苏要点与注意事项一、细胞冻存的要点细胞冻存，听起来挺高大上的，但其实也没那么复杂。
就是把细胞冻起来，给它们放个长假，好让它们在需要的时候再“复职”。
但要记住，冻存细胞可不是随便丢进冰箱里就行，得注意方法。
温度得低，低得不能再低，最好是80°C以下。
别觉得温度不够冷就行，这可是关系到细胞生命的大事。
冻存时得加入保护液。
这可不是随便加点水就完事了哦，保护液能够防止细胞在冻存过程中被冰晶伤害，基本上就是给细胞穿上了“防护服”。
细胞一旦冻得太快，冰晶直接把它们“刺穿”，那可就“前功尽弃”了。
所以，冻存前一定要调整好冻存液的浓度，确保它们能够抵御极端的低温。
然后，冻存管也是不能忽视的东西。
有些小伙伴会想，随便找个试管就行，管它呢，反正又不是常常冻存。
错！选择合适的冻存管十分重要。
要选那种专门设计来抵抗极低温的，耐得住寒冷，不容易破裂。
冻存过程中的速度也要掌握好，最好采取缓慢冷冻的方法。
这就像是煮菜，火候得控制好，一气呵成，不急不躁。
别急，慢慢来，让细胞慢慢适应低温环境，这样冻存后的细胞才能保持活力。
二、细胞复苏的注意事项细胞复苏，那可不是拿出来就能“复活”的事儿。
复苏要讲究技巧，手法不对，可能细胞就彻底“挂”了。
别急着拿到室温，复苏时的水浴温度得控制在37°C左右，别冷别热，正好是刚刚好。
水温太低，细胞可能会冻伤，太高，细胞又可能“炒了”。
所以，找个合适的水浴来进行复苏，保持恒温，避免温差大。
一定要小心操作，千万别把细胞冻管拿出来就直接丢进水浴里。
要慢慢放入，避免细胞一瞬间受到过大的温差刺激，这样才能给细胞一个舒适的复苏环境。
复苏之后，得立马将细胞从冻存液中取出并轻轻处理，注意要避免剧烈的摇晃和振动。
为什么呢？细胞就像是脆弱的花朵，千万不能对它们粗暴，否则细胞就“心情不好”了。
取出后，迅速把冻存液去除，因为这液体对细胞可能是有害的，复苏后如果还残留太多保护液，细胞可受不了，容易引发过敏反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞冷冻保存方法、注意事项
1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。
2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
3、注意冷冻保护剂之品质。
DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。
Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4、冷冻保存之细胞浓度：
（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。
5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
6、冷冻方法：
（1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
（2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
7、材料：
（1）生长良好之培养细胞
（2）新鲜培养基
（3）DMSO (Sigma D-2650)
（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
（5）0.4 ％w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
（6）血球计数盘与盖玻片
（7）等速降温机(KRYO 10 Series II)
8、步骤：
（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。
（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
（5）冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
（6）冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。
程序为: program 7: HB CELL
细胞的复苏经验总结
在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。
【材料】
1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。
2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。
【操作程序】
1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。
3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。
4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。
7.记录复苏日期。
【注意事项】
1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMS O）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（D MSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
推荐一种简单实用的细胞冻存方法
冻存液：一般用10%DMSO(推荐用sigema原装的，质量好不用预消毒)+10％血清的完全培养基，如果细胞珍贵的话最好用10％DMSO＋90％全血清。
降温方法：用最少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹，扎紧，直接放入-70度冰箱，隔夜取出冻存管直接放液氮冻存。
复苏效果对比：细胞冻存2周后复苏，本方法冻存的细胞与使用程序性降温仪冻存的细胞复苏效果相差不大，但明显比传统4度、-20度、-70度的方法要好，传统的冻存方法不但费时费力，而且各时间段的放置时间并无严格统一，尤其在4度和-20度时间不好掌握。
要点：面纱包裹一定要足够厚，细胞用冻存液重悬后不要在常温放置太长时间。
从-70度取细胞的时间无严格控制，我们曾经放过一个星期后在入液氮，同样可以顺利复苏。