细胞冷冻保存方法、复苏经验总结

细胞冷冻保存方法、注意事项

1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 –90 ％致密度。

2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron F GLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

4、冷冻保存之细胞浓度：

（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml

（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。

（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。

（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 10 6cells/ml。

5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

6、冷冻方法：

（1）传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 长期储存。

（2）程序降温：利用等速降温机以–1 ～-3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。

7、材料：

（1）生长良好之培养细胞

（2）新鲜培养基

（3）DMSO (Sigma D-2650)

（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

（5）0.4 ％w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

（6）血球计数盘与盖玻片

（7）等速降温机(KRYO 10 Series II)

8、步骤：

（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

（5）冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。

（6）冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

细胞的复苏经验总结

在细胞复苏过程中，有多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，现将细胞复苏的操作程序和注意事项总结如下，望能为同行提供些参考。

【材料】

1.常规细胞培养仪器设备、恒温水浴振荡器。

2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）。

【操作程序】

1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3.二甲基亚砜（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min，备用。

4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。

7.记录复苏日期。

【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMS O）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（D MSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

推荐一种简单实用的细胞冻存方法

冻存液：一般用10%DMSO(推荐用sigema原装的，质量好不用预消毒)+10％血清的完全培养基，如果细胞珍贵的话最好用10％DMSO＋90％全血清。

降温方法：用最少两厘米厚的医用棉纱将冻存管紧紧包裹，扎紧，直接放入-70度冰箱，隔夜取出冻存管直接放液氮冻存。

复苏效果对比：细胞冻存2周后复苏，本方法冻存的细胞与使用程序性降温仪冻存的细胞复苏效果相差不大，但明显比传统4度、-20度、-70度的方法要好，传统的冻存方法不但费时费力，而且各时间段的放置时间并无严格统一，尤其在4度和-20度时间不好掌握。

要点：面纱包裹一定要足够厚，细胞用冻存液重悬后不要在常温放置太长时间。从-70度取细胞的时间无严格控制，我们曾经放过一个星期后在入液氮，同样可以顺利复苏。