亚慢性经口毒性实验设计全

硫酸铜亚慢性经口毒性实验设计

一、实验目的

通过该实验不仅可获得一定时期内反复接触受试物后引起的健康效应、受试物作用靶器官和受试物体内蓄积能力资料，并可估计接触的无有害作用水平，后者可用于选择和确定慢性实验的接触水平和初步计算人群接触的安全性水平。

二、实验原理

1.亚慢性毒性实验：是指在实验动物部分生存期内，每日反复经口接触受试物后所引起的不良反应。

2.无有害作用水平（No-adverse-effect level）：是指在实验中不引起任何有害作用的最大染毒剂量，可用每日单位动物体重接触受试物的重量(mg/kg)表示。

三、实验仪器及试剂

实验试剂：3%-5%苦味酸、0.5%酸性品红、蒸馏水、无水硫酸铜、水、动物饲料

实验动物：健康、6-8周大鼠（80只）

实验仪器：灌胃针（16号）、电子天平、动物体重秤、饲养室、烧杯、容量瓶、吸量管、吸耳球、胶头滴管、手术剪、托盘、镊子、药匙等

四、实验步骤

1. 实验动物的选择：选择80只6-8周，体重在50-100g的健康大鼠，大鼠体重相差不超过10%（±5-10g）。

2. 实验管理：实验前动物先适应环境和饲料5天。适应期间和实验期间雌雄分笼饲养，所有动物通过灌胃的方式进行染毒，每周染毒7天，连续染毒90天。

3. 实验条件：饲养室温度控制在22±4℃，相对湿度在40%-70%之间，无对流风，昼夜各半。实验期间正常饲料喂养，饮水不限。

4. 实验动物染色和分组

1）抓取大鼠：抓取大鼠前最好戴上防护手套。进行染色时，可采取左手固定法，只是用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏大鼠背部皮肤，这样便可进行各种简单的实验操作；也可以用左手食指和中指放在颈背部的两侧，拇指和无名指放在胸前，分别用手指夹住左右前肢抓起来。

Tips：辨认大鼠的雌雄：观察生殖器与肛之问的距离，雌性较雄性近具沟；观察生殖突起，雄性较大、较圆，雌性较小具裂缝；仰卧观察乳头，雄性不明显，雌性明显。

2）染色编号：用黄色3%-5%苦味酸0.5%酸性品红对动物进行染色标记，黄色和红色分别代表个位和十位。大鼠分为左、中、右三区，左上区、左中部和左下肢分别表示1、2、3或者10、20、30，如图1。

图1

3）称重：

（1）使用前，先检查动物称的称量盘是否干净，若有脏污，应清洁干净后再装好， 确保称量盘中没有任何东西。

（2）将专用的动物体重称放平并调好零点；

（3）将专用的称量容器置于体重秤上，对体重秤作去皮重、回零调整； （4）取已编号的动物逐一放入专用容器中，读取电子秤显示的动物体重并记录。 4）随机分组：80只大鼠分成随机分4组，分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组、对照组，每组20只，且雌雄各半。

（1）在随机数表上任意指定一个点抄录数字，抄录的数字个数等于区组数减1，并以横向的顺序抄录数字，本实验4个区组抄录3个数字。以后的区组按顺序依次抄录数字； （2）每个区组的随机数字除以4，得到的余数可为0,1,2,3。余数为1分配到高剂量组；余数为2分配到中剂量组组；余数为3分配到低剂量组组；余数为0分配到对照组。如2个编号的余数相同，后一个编号的分配依次后退1组。区组第4个数字为填补余缺，组内缺那组就填入哪组。

5.剂量设计与剂量分组

根据《中华人民共和国化学品啮齿类动物亚慢性经口毒性试验方法》GB/T 21763-2008及急性经口毒性实验的结果，剂量设计为表1：

表1：实验剂量分组表

6.灌胃处理

每日早上8点对大鼠进行一次性灌胃，每天对大鼠进行正常饲料喂养。

灌胃量（mg/kg ）=大鼠最初的体重（kg ）*标准灌胃量（ml/kg ）*各组硫酸铜溶液浓度（mg/ml ） 1）硫酸铜溶液的配制：溶液配制采用称量法，等容量稀释，每只大鼠灌胃等量的硫酸铜溶液。采用1: K 系列稀释法配制不同浓度的受试液，以组间浓度间隔3倍递减（K=3）

，确定

各剂量组所需受试液浓度；

A:已知实验最高剂量组剂量（mg/kg）为LD50/20,大鼠按等容量方法给予受试药液，即10ml/kg,故预实验最高剂量组所需受试液的浓度（mg/ml）(母液浓度)为LD50/200（C1）；

B:选择蒸馏水作溶剂配制浓度为C1的受试液，取M ml作为母液，从母液中取出m ml供丙组（最高剂量组）用，然后取m ml溶剂加入剩余母液中混匀，稀释后的母液浓度为

C2(C1:C2=1:K)，即中剂量组所要求的浓度；

C:从中取出m ml供中剂量组接毒用，然后再加入m ml溶剂，其稀释后的浓度为

C3(C2:C3=1:K), 即低剂量组所需的浓度。

D：确定母液总量：M=m/1-K

2）大鼠的捉拿与固定：

（1）根据步骤四-4-1）捉拿大鼠。

（2）将大鼠捉拿出鼠笼后，放在粗糙的物体表面。一只手用一定力度将大鼠向尾巴方向拉紧，这时动物会抓紧粗糙面不放，立即用另一只手的大拇指和食指抓住大鼠的耳后及双耳之间的皮肤，固定大鼠的头部，使其不能左右摇晃。

（3）中指和无名指将大鼠背部皮肤压在手掌中，使大鼠背部皮肤拉紧，限制其四肢的活动。最后将小指压在大鼠尾根部，防止大鼠在灌胃过程中尾巴来回甩动，以确保灌胃的顺利进行。3）灌胃器的插入与推注：

（1）将大鼠固定好之后，在灌胃器插入大鼠食道之前，一定要将大鼠头部与颈部处于一条直线上，可以通过拇指与食指的调动完成。

（2）将灌胃针沿大鼠的左侧嘴角进针，先从口角插入口腔内，然后用灌胃针往后压住大鼠头部，使其口腔与食道成一直线。

（3）再将灌胃针从舌面紧沿上腭进入食道。这时有的大鼠会出现类似于人的呕吐反应，这是正确的反应。然后继续轻轻进入，灌胃管插入约1/2 处。

（4）药物推注一定要缓慢，慢慢推注顺利后，可以加快推注速度。

4）记录

如表2

表2：灌胃处理记录表