蛋白质组学入门问题faq
蛋白质组学常见问题解答
1、iTRAQ和label-free所用的搜库软件及其版本、定量分析软件是否一致？答：搜库软件是不一致的：iTRAQ数据采用Mascot(2.3.0）；label-free则是maxquant（1。
4。
1.2）。
2、iTRAQ/TMT和Label-free技术都有哪些优缺点？答：(1）定量准确性：iTRAQ/TMT的定量准确性和重现性要明显优于Label—free，Label-free的样本之间不能直接混合，导致定量的结果受到的影响因素多，因此定量结果的准确度较低；（2）鉴定通量：Label-free通量相对较高，而iTRAQ/TMT由于标记基团的影响，鉴定通量较label-free 低；（3）修饰组学：label-free定量，修饰肽段的富集(即IP）是各组分开进行的，很可能造成富集的不平行,最终造成定量不准确。
因此，我们通过加入内标肽段来归一化以减少富集步骤引入的误差。
而iTRAQ/TMT标记的修饰组,修饰肽段的富集是各组标记、混合后同时进行的，所以不会存在富集的不平行。
因此，修饰组的定量,iTRAQ/TMT方法的定量准确性优于label—free；（4)其它：目前泛素化修饰定量组学只能用label—free来做。
3、常用的蛋白质翻译后修饰参考数据库有哪些?4、HPLC分级的标准及作用是什么?是否组分越多通量越高?答：HPLC分级有两个目的：1。
降低每个组分中蛋白的复杂度，利于质谱鉴定；2.增加每个组分中每个蛋白的含量，同样利于质谱的鉴定。
组分的多少和样品的复杂程度有关，如果分级数太少，没有达到降低样品复杂度的作用，如果分级数目太多，反而会降低每个组分中每个蛋白的含量，并且组分越多蛋白损失越大,因此分级太少和太多都不利于质谱鉴定,我们公司的分级数目是经过系统考察得到的最优选择.5、公司目前使用的蛋白浓度测定方法是什么？答:我们的蛋白浓度测定使用GE公司的2D Quant kit完成，该试剂盒可耐受8 M urea和2% SDS，明显优于其它浓度测定方法。
蛋白质组学相关问题与解答
蛋⽩质组学相关问题与解答1．为什么通过elisa、WB能检测到的蛋⽩在itraq实验中没有检测到？⼈⾎浆中的蛋⽩是有上万种的，⽽⼀般质谱只能检测到五六百种，也就是说只占了其中的百分之⼏，这是普遍现象，说明咱们的⽅法是不存在问题的；其次，ELISA/WB与质谱相对来说灵敏度不⼀样，前者具有放⼤效应，因为其间会⽤到相应的抗体，所以只要选对抗体，感兴趣的蛋⽩基本都会被检测到；因此， ELISA/WB检测到的蛋⽩在组学中没有被检测到也是正常的。
2．itraq的结果，⽤elisa验证了两个差异蛋⽩，发现都是阴性结果，是什么情况，出现阴性的概率有多⼤？⼀般我们会提到这个概率吗？iTRAQ结果中，选择的蛋⽩是否得分够⾼，变化倍数⼤不⼤，选择的抗体特异性是否好，都可能会影响WB和iTRAQ的结果，如果以上三⽅⾯没有什么问题的话，基本上80%还是⽅向⼀致的。
3．iTRAQ、TMT、Labe lfree实验⽤的是什么质谱仪，其定量是基于⼀级质谱还是⼆级质谱？基于LC-MSMS的实验技术主要使⽤的是ABI5600-Triple-TOF，同时公司也具有Thermo Q-Exactive质谱仪平台，部分实验项⽬使⽤的是QE-Exactive完成。
其中标记定量技术iTRAQ和TMT是依据⼆级质谱的报告基团离⼦峰进⾏定量，⽽Labe lfree是基于⼀级质谱峰进⾏定量。
4．蛋⽩组学实验⽂章⼀般发表在哪些期刊上，各有什么区别？MCP（molecular & cellular proteomics（影响因⼦7分左右）JPR(journal of proteome research（影响因⼦5分左右）Proteomics（影响因⼦4分左右）Journal of Prteomics(影响因⼦4分左右),Electrophoresis(影响因⼦4分左右),Plos One(影响因⼦3分左右),其它的杂志还包括BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci5．有两个Mix混样，在计算差异表达蛋⽩时如何使⽤？计算差异表达蛋⽩时，将WT组（113、114、115）与Mix1（119）和Mix2（121）的⽐值取平均值，APO1组（116、117、118）与Mix1（119）和Mix2（121）的⽐值取平均值，平均值再进⾏差异筛选。
蛋白质组学
8、2D电泳的原理。
基本原理IEF-SDS-PAGE是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
9、2D电泳图像分析流程。
☐凝胶图像的扫描：☐图像加工：☐斑点检测和定量：☐凝胶配比：☐数据分析：☐数据呈递和解释：☐2-DE数据库的建立：10、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是什么？SDS的作用是什么？基本原理:天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。
可得到天然蛋白质的分子量。
①聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。
②加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。
11、等电聚焦电泳中，载体两性电解质pH梯度电泳与固相pH梯度电泳有何区别？（1）载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳是在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的线性的PH梯度（预电泳）。
当蛋白质放进此系统时，靠近阳极的侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的侧的蛋白质处于碱性环境中，带负电和向正向移动，最终都聚焦于其等电点相当的PH位置上，形成不同的蛋白质区带。
目前在样品分析中趋向于选用超薄水平板式，具有分析样品多，两性电解质用量少，结果重复性好等优点。
（2）固相pH梯度等电聚焦是基于凝胶中的固相pH梯度。
这些具有弱酸或弱碱性物质的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点位置迁移，直到到达自己的等电点。
蛋白质组学研究内容和相关技术
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
蛋白质组学期末复习
蛋白质组学期末复习1、基因组genome：一个细胞或病毒所包含的全部基因。
通常在真核生物中指一个物种的单倍体染色体组所含有的一整套基因。
原核生物一般只有一个环状DNA分子，其上含有的基因为一个基因组。
2、基因组学genomi cs：从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
3、功能基因组学：利用结构基因组学提供的信息，通过在基因组或蛋白质水平上全面分析基因功能，使生物学研究从单一转向系统。
其主要研究内容包括：基因功能发现，基因表达分析，突变检测等。
4、蛋白质组：是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。
是一个整体概念。
5、蛋白质组学(Proteomics)：是以蛋白质组为研究对象，从蛋白质整体水平上来认识生命活动规律的科学。
蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平，从整体，动态，定量的角度去研究基因的功能，是后基因组计划的一个重要组成部分。
是对特定时间或特定环境条件下，细胞内完整表达状况的研究，代表了正在工作的基因组的情况，是一个动态过程。
集中于动态描述基因调节、对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定、鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。
旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式和功能模式，其内容包括蛋白质的表达与存在方式（修饰方式），结构与功能，以及各个蛋白质之间相互作用等。
是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以及功能蛋白质组学。
6、功能蛋白质组(functional proteome)：细胞内与某个功能有关或在某种条件下的一群蛋白质；又指特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。
7、基因组与蛋白质组的异同点：基因组蛋白质组相同点都属于整体概念, 蛋白质组是基因组的反映，但不是一个基因组的直接产物不同点均一性和完整性特殊性和多样性非常稳定，不易发生改变可变性，高度动态的基因组在同一生物体的所有体细胞中是均一的，完整的，稳定的，成分不随时间变化（终身不变）；组成该有机体的所有不同细胞都共有同一个基因组。
分子诊断学：蛋白质组学(Proteomics)
四. 蛋白质组学的研究内容及技术
表达蛋白组学 （2-D电泳）
结构蛋白组学 （晶体结构分析）
功能蛋白组学 （EMSA,COIP等）
五、蛋白质组研究的相关技术
（一）蛋白质的分离
1. 二维凝胶电泳（two dimensional electrophoresis， 2-DE）。 2. 操作
（1）等电聚焦 凝胶电泳 （2）SDS-PAGE电泳 （3）图像分析
理并寻找全新的药物作用靶点。 3. 蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。 4. 对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进
化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。 5. 追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导
途径中的位置。
Screen the differentially expressed proteins
三明治
• 封闭 印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA/脱脂奶粉） →一抗特异性的结合抗原（一抗孵育）
• 二抗孵育 适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理 后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的 位置，即是待研究的蛋白质的位置。
• 显色/发光 印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理， 当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见 的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。
2. 蛋白质组学（proteomics） 是对在特定时间和环境下所表达的群体蛋白质研究的一门 学问
蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者 Ｗｉｌｋｉｎｓ等于 1994年提出。
同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的 知识体系,而是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模 式及功能模式,其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内 定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能,是基因组ＤＮＡ序列 与基因功能之间的桥梁。
蛋白质组学思考题
一、简述根据MS/MS 进行蛋白质鉴定（注意不是多肽）的过程。
答：这种仅通过二级质谱图来鉴定多肽的方法又称为De novo Sequencing 。
PSM （Peptide-Spectral Match ）肽谱匹配
根据下图说明，在从多肽推断蛋白的时候是如何应用奥卡姆剃刀法则的，如何评价应用该法则获得的蛋白质鉴定结果？
答：如果你有两个理论，它们都能解释观测到的事实，那么你应该使用简单的那个，直到发现有直接的证据支持更为复杂的那个理论。
找到最少的一组蛋白，包含鉴定到的全部多肽序列。
拥有更多高可信度多肽的蛋白的可信度最高；选择至少有两个肽的蛋白，或者保留单肽鉴定的蛋白，但要求这个肽具有极高的可信度；可用反相数据库方法估计Protein FDR，也可用其它基于概率的方法，Protein FDR通常大于peptide FDR。
蛋白质组学入门soeasy
蛋白质组学入门soeasy蛋白质组(Proteome)的概念最早由澳大利亚的科学家Marc Wilkins1994年在意大利参加一个大会时提出,指由一个基因组(genOME),或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein)。
从英文字面上看，我们知道这是一个合成词。
那么作为一个进入实验室的小白如何才能理解蛋白质组学的思维方式呢？首先我们得理解”组学”这个概念。
从中文字面上看的话就是研究很多东西的一门科学。
从英文的角度来看看，我们会发现很多有意思的东西，Omics是组学的英文称谓，它的词根'-ome'英译是一些种类个体的系统集合，例如Genome（基因组）是构成生物体所有基因的组合，基因组学（Genomics）这门学科就是研究这些基因以及这些基因间的关系。
自基因组(genome)和基因组学(genomics)两个名词诞生至今，现在已有成千上万的“组(omes)”和“组学(omics)”出现。
涓涓细流也能演变成泛滥洪水，过去10年中”组omes”和“组学omics”成了科学界的流行语，难怪美国加州大学戴维斯分校的进化生物学家乔纳森·艾森曾称它们为语言的寄生虫“languageparasite”。
可见组学的发展之快，相信就算是小白也能信手拈来几个：基因组学（Genomics），蛋白组学（Proteinomics），代谢组学（Metabolomics），转录组学(transcriptomics），脂类组学（lipidomics），免疫组学（Immunomics），糖组学（glycomics ）之类的。
那么蛋白质和组学结合在一起——蛋白质组学通俗的讲就是研究一堆蛋白质的科学。
我们的研究对象不是一个蛋白，而是一堆蛋白。
既然我们的研究对象是蛋白质，那么我们首先得得到这些蛋白质，学术点说如何去提取蛋白质呢？下面小编以常见的贴壁细胞为例（此方法仅供学习提取蛋白质步骤，不建议实际操作）1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
蛋白质组分问题回答
蛋白质组分
蛋白质组分是指一个生物体中所有蛋白质的种类和数量。
在生命的过
程中，蛋白质是一种非常重要的生物大分子，不仅能够构成细胞的各
种结构，还可以参与到代谢、信号传导、内分泌等许多生命活动中。
蛋白质组分的研究可以从不同层面入手，比如从组织器官、细胞、亚
细胞结构、代谢通路、功能模块等层面去研究。
最近几十年，随着生
物技术的迅猛发展，许多高通量技术被用来研究蛋白质组分，比如蛋
白质质谱、蛋白质芯片、蛋白质酶解、蛋白质交联等。
利用这些研究手段，已经可以获得许多生物的蛋白质组分数据。
比如，对某些生物的基因组测序之后可以得到预测的蛋白质序列，然后通过
蛋白质质谱等手段验证，最终确定该生物的蛋白质组分。
此外，还可
以通过比较不同个体、不同组织、不同环境等条件下的蛋白质组分变化，来研究蛋白质组分在生命过程中的调节机制。
蛋白质组分研究的进展，不仅可以为基因组学、生物学、医学等学科
提供重要的数据支持，还可以开发新型的蛋白质药物、诊断试剂、农
业生物技术等领域的应用。
虽然蛋白质组分研究还存在诸多挑战，比
如技术的限制、样品的获取和处理、数据分析等难点，但随着生物技
术的突飞猛进，相信在不久的将来，我们会更加深入地认识生命的奥秘。
看完这本蛋白质组学问题秘笈，都可说是学霸本人了（上）
看完这本蛋白质组学问题秘笈，都可说是学霸本人了（上）问题1蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素?答：质谱鉴定不成功主要可以分为两类，一类是质谱效果不好，一类是没有可参考的蛋白数据库。
质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低（常见银染的点）、蛋白酶解及质谱操作失误等。
要避免这些因素需要尽量取颜色深一些的蛋白点，并且取的蛋白点面积需要适当大一些，对于某些很小但很清晰的蛋白点，取点的时候可适当选择孔径大一些的枪头，把边上空白处适当取到一些也不要紧，避免取点混入其他的蛋白点。
其次，由于没有合适的数据库导致的鉴定效果较差，可以通过更换范围更大的数据库、近缘物种数据库、采用相关研究物种的蛋白、EST数据库等构建本地数据库的方式进行解决。
问题2凝胶内的蛋白样品是否可以长期保存？如何运输？对质谱鉴定有何影响？答：如果保存时间超过一周，可以将蛋白点切取后放入-20℃或者-80℃冰箱保存；如果小于一周，则可以常温保持，基本不会影响后续质谱鉴定效果，运送时常温快递即可。
问题3iTRAQ/TMT技术相对于电泳技术有什么优势?答：2-DGE是伴随着MALDI-TOF技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开，实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张2-DGE能鉴定到的蛋白质总数最多1000～2000蛋白。
相较于2-DE以及DIGE等基于电泳的技术，iTRAQ/TMT分辨率高，博苑生物进行的细胞样品最多有发现超过6000个蛋白，并且绝大多数蛋白都有定量和定性信息；其次iTRAQ通量高，可以一次最多完成8个样品的实验，如果使用TMT技术最多可以一次完成10个样品的实验，特别适合于多组样品间的同时比较以及生物学过程的动态检测。
最后，鹿明生物提供的iTRAQ完整实验服务中包括iTRAQ/TMT 实验中鉴定到的所有蛋白的定性和定量结果、差异筛选结果、并且免费提供差异蛋白的维恩图分析、聚类分析、热图分析、GO、Pathway、蛋白互作等生物信息学分析内容以及中英文双语的分析报告，除此之外还可以根据客户的需求提供个性化的服务，免去了数据分析的烦恼。
iTRAQTMT蛋白质组学分析基本知识点
iTRAQTMT蛋白质组学分析基本知识点蛋白质组（Proteome）一词源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组与转录组有许多相似之处，也具有时空特异性，会随着环境、组织或个体的改变而改变。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢、生长发育以及各种胁迫反应等过程的整体而全面的认识。
iTRAQ和TMT的结构与区别iTRAQ和TMT是近年来应用最广泛的差异蛋白质组学技术，它们均采用体外标记的方法，利用同位素试剂标记蛋白质酶解后产生的多肽，对两个或多个样本，在全蛋白质组层面上展开相对定量分析。
说到这里,很多人可能会认为iTRAQ和TMT是两种不同的定量技术，其实二者只是不同厂家生产的（iTRAQ是AB SCIEX研发，TMT 是Thermo Fisher研发），在标记规格（iTRAQ是4标和8标的；TMT是2标、6标以及10标的）、标签分子结构上有些许差异，其他原理基本一样。
Questions and Answers1、iTRAQ/TMT与Label free相比有什么优势？Label free无需同位素标记，不受样本条件的限制，定性没有问题，但是定量的准确性不高，会受到质谱重复性等因素的影响。
iTRAQ/TMT的覆盖度高、灵敏度高、重复性好。
但是在混标上机时要充分考虑样品的情况，样品数量较多时，实验设计会较为复杂。
2、做iTRAQ/TMT蛋白质组学分析，不同老师的样本可否放在一组上机？不同老师的样品或者同一个老师不同实验的样品，都不能放在一组上机。
不同的物种的样品，在搜库的时候选择的数据库不一样，无法进行搜库比较。
同一个物种的不同处理的样品，经过不同实验室处理后，样品里的蛋白种类和丰度会有较大差别，混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定。
蛋白质组学常见问题及解答
蛋白质组学常见问题及解答作者：未知来源：华大中生科技公司点击：129 时间：2006-9-12Q: 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？A: 一般情况下是可以的。
但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D胶后，会有很多横向条纹。
所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
Q: 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？A: 这是因为BioRad的电泳槽有个盖子。
为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。
由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。
如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。
为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 ％满）的矿物油。
Q: 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？A:刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。
Q: 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？A: 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
Q: 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？A: 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
Q: 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？A: 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。
蛋白质组学质谱问题个人总结(DOC)
1.色谱柱中为什么极性大(盐)的组分要用极性较大的溶剂洗脱吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。
对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高，但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。
供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种，本实验选择中性氧化铝。
化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强。
对氧化铝的吸附性递减：酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃。
先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性要低，体积要小。
如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。
色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。
然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来.2.反相色谱，是非极性固定相和极性流动相，用于分离非极性或者弱极性物质。
我想请教的是，如果流动相极性偏大，是不是分离效果不好？还有就是如果分离度不好，加大水的比例，延长保留时间，会不会影响到分离效果？对于液相色谱分离，影响因素多，有两点因素最影响分离，第一是物质与流动相的极性，第二个叫洗脱能力:出峰快与慢以及分离效果，用极性来理解出峰顺序，反相色谱一般使用强度因子来表示，一般极性参数大的，强度因子就小，但甲醇与乙腈比较特殊，极性参数甲醇与乙腈分别为5.1与5.8，强度因子却是甲醇3.0，乙腈3.2。
蛋白质组学简介？蛋白质组学的详细步骤
蛋白质组学简介？蛋白质组学的详细步骤
1.什么是蛋白质组学
(Marc Wilkins（1994))
A study of proteome using the technologies of large-scale protein separation, identification and quantitation.
The study of proteins, how they're modified, when and where they're expressed, how they're involved in metabolic pathways and how they interact with one another.
简而言之：蛋白质组就是一个特定的生物系统中（特定时间、空间）存在的所有蛋白质及其相互作用
2.蛋白质组学不能被基因组和转录组取代
基因和蛋白并不存在严格的线性关系
ORF并不预示一定存在相应的功能性基因
mRNA水平并非与蛋白质的表达水平对应
翻译后修饰及同工蛋白质（isforms)等现象在基因水平无从表现
3.蛋白质组学的工作流程
•样品上质谱，获得Raw data(质荷比+强度）
•使用MaxQuant等搜库，获得初始结果（肽段、蛋白信息）
•质控得到可信结果（包括修饰等）
•定性分析和定量分析
•数据注释、数据挖掘、关联功能。
蛋白质组学入门第二弹
蛋白质组学入门第二弹举个例子，我们对编号为“123456”一共6个样本进行定量后，每个样本分别上相同质量的蛋白样本进行跑胶，我们大致得到如下的胶图，看看条带的均一性，样本定量是不是准确，如果满足要求我们就可以进行下一步的定量蛋白组学实验了。
截了个没有marker的图，希望大家不要介意。
但是一不小心，如果图跑成这样又或者跑成这样那就悲剧了，这个......肯定是没法用了，那就得找问题了，继续跑胶看看是蛋白质降解，制胶问题，又或者是跑的过程中漏液等等。
我们知道蛋白质组学的主要检测工具是质谱仪，但是我们知道蛋白是大分子，分子量一般比较大（从几kD到几百kD），因此我们需要将它们进行酶解成小分子。
酶解的具体步骤各大神器网站和文献中都能找到，小编就不多废话了，直接给大家抛出几个酶解中常见问题解答。
1.用 Trypsin 酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？酶解时碳酸氢氨的浓度一般在 10 ～50 mM 之间。
碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境，因为Typsin 的活力在pH8 ～9 之间最高。
最常用的碳酸氢氨浓度有 20 mM，40 mM 。
2.Trypsin 储存液的作用是什么？Trypsin 在pH8 ～9 活力最高，所以为了防止酶的自水解，Trypsin 母液要处于一个酸性的环境里以便长期保存。
Trypsin 储存液的 pH 大约是5.3 ，是用来稀释母液用的。
如果所需的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。
如果酶解的样品少，可以用储存液来稀释，这样剩余的酶液可以在 -80℃保存到下次使用。
3. 什么情况下需要用 Ziptip 来处理样品？当样品含有大量的盐时，需要用Ziptip 来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（20 微升以上）时，需要用Ziptip 来浓缩。
如果样品中有甘油， SDS ，或其他杂质时， Ziptip 的使用要格外当心，在这种情况下， Ziptip 的填料容易被杂质堵塞；另外 Ziptip 使用不当时，样品会有损失。
常见问题汇总
常见问题汇总蛋白&抗体篇1.WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况？答：(1)首先要确定这条带的大小；比如，组蛋白H3的信号会很强，经常出现在17kD左右，如果曝光时间短的话，很可能只存在信号强的条带；(2)上样量是否足够；(3)抗体浓度是否正确使用；(4)荧光底物不灵敏，可调整荧光底物的孵育时间、曝光时间等。
2.WB实验中是否条带越多，蛋白修饰的丰度越高？答：(1)客户提到的修饰丰度指什么，是一种蛋白的修饰强弱，还是指修饰的广谱性？(2)同一样品，不同处理的对比，可以这么说；(3)不同样品，不同来源，无可比性；(4)条带的强度，可以体现该条带大小的蛋白修饰丰度高。
3.能否用泛抗体检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号？答：我们公司的蛋白质修饰泛抗体是指可以识别所有含该类修饰的蛋白质的抗体，与组蛋白位点特异性修饰抗体的区别在于不局限于某个蛋白的某个位点。
如Lys三甲基化的修饰泛抗体可以识别所有含有Lys三甲基化的蛋白，而组蛋白H3K4Me3就只能特异性的识别组蛋白H3第4位Lys的三甲基化修饰。
因此泛抗体是可以用来检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号。
4.抗体产品用途；如是否可以做ChIP? IP效果如何？答：(1)抗体可以用来做WB，ELISA，Dot，IP，IF（免疫荧光）等；(2)我们的泛抗体可以用来做肽段水平的IP且效果非常好，但不建议直接做蛋白水平的IP，效果不是很好，客户用我们的位点特异性抗体尝试做过IP，结论是可以的；(3) ChIP：我们没有用自己的抗体专门做过相关的检测，但我们也准备对此进行验证。
5.抗体可以做免疫组化么？答：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
我们的抗体是可以做免疫组化、WB、ELISA等实验。
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蛋白质组学入门问题FAQ常见问题———HPLC 篇1 ．HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足：解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多：调整衰减即可。
检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡：解决办法为排气。
记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
流动相流量不合适：调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
2 ．做HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决?原因可能有：泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，更换比例阀即可。
泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；系统检漏，找出漏点，密封即可。
梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
3 ．我购买的HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么?柱压过高是HPLC 柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10 倍柱体积的流动相冲洗柱子，( 此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性) 。
这时，如果柱压仍不下降，再检查；更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE 提供的Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 ．液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。
双向电泳篇1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑2D 的一向吗？一般情况下是可以的。
但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完1D 和2D 胶后，会有很多横向条纹。
所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为BioRad 的电泳槽有个盖子。
为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。
由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。
如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。
为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（80 ％满）的矿物油。
3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是pH 指示剂，当它移动到酸性区时（pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
当蛋白移动到相应的pH 值后，就变成了中性分子。
而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。
而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
10. 怎样估计2D 胶上蛋白质点的分子量和pI 值？可以用BioRad 生产的2D 胶标准蛋白来校准。
也可以用体系内已知蛋白来做比对。
11. 为什么2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？横的脱尾可能是：1 ）一向等电聚焦不完全；2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）；3 ）蛋白的丰度太高。
竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分会影响2D 胶的效果？核酸，盐，去垢剂等等。
13. 2D 胶的上样量应该在什么范围？上样量和样品有关。
样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。
一般的全细胞裂解体系，上样量大概在100 微克（银染）到500 微克（考染）之间。
14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？蛋白质的浓缩有很多方法。
大致有超滤法，沉淀法和透析法。
超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。
它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。
另外超滤对样品的要求比较高。
甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。
沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。
缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。
沉淀法中，又以TCA 法最为普遍使用。
使用TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的TCA 和其他沉淀下来的杂质。
透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。
透析法可以和超滤法联用。
先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
酶解篇1. 用Trypsin 酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？酶解时碳酸氢氨的浓度一般在10 ～50 mM 之间。
碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境，因为Typsin 的活力在pH8 ～9 之间最高。
最常用的碳酸氢氨浓度有20 mM ，40 mM 。
盐浓度过大时，后续的冻干过程中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性pH 的水解环境（尤其是在样品的pH 值低，而且体积大时）。
为了确定酶解体系的pH 值，可以用2. Trypsin 储存液的作用是什么？Trypsin 在pH8 ～9 活力最高，所以为了防止酶的自水解，Trypsin 母液要处于一个酸性的环境里以便长期保存。
Trypsin 储存液的pH 大约是 5.3 ，是用来稀释母液用的。
如果所需的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。
如果酶解的样品少，可以用储存液来稀释，这样剩余的酶液可以在-800C 保存到下次使用。
3. Roche 的酶和Promega 的酶，那个更好？Roche 的酶有自降解，而Promega 的酶基本上没有自降解。
由于酶的自降解峰可以用来做很好的内标，所以一定限度的酶自降解对MALDI 数据的校准很有帮助。
4. 什么情况下需要用Ziptip 来处理样品？当样品含有大量的盐时，需要用Ziptip 来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（20 微升以上）时，需要用Ziptip 来浓缩。
如果样品中有甘油，SDS ，或其他杂质时，Ziptip 的使用要格外当心，在这种情况下，Ziptip 的填料容易被杂质堵塞；另外Ziptip 使用不当时，样品会有损失。
所以当样品比较珍贵（的来不易）时，最好先用其他样品做预实验，摸顺条件后，再作真正的样品。
MALDI 篇1. 怎样邮寄我的样品？冻干的胶或干粉可以直接邮寄。
切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在EP 管中( 不加任何缓冲液) ；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。
液体样品的邮寄方式同湿胶一样。
2. 为什么要使用内标？用内标做校准可以大大减少MALDI-MS 的误差（<70ppm ），从而提高查库结果和可靠性。
好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一线）；质量不要在大多数的肽段范围内（1200 ～2500 Da ）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的抑止要小。
我们实验室使用的内标是25fmol 的——和——。
不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（<150ppm ）。
所以，顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。
3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供(exact) 对照两块胶？正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。
负对照（空白胶）主要是看样品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要是检测酶解和质谱的效果是否正常。
如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先准备的胶条。
如果顾客的样品量大（>10 个2D 胶上的点），则顾客必须提供正负对照。
4. 对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。
分子量在 2 － 5 万之间的蛋白质，鉴定成功率一般比较大。
分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（1000 ～3000 Da ）就少，所以鉴定的成功率相对较低。
而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情况下，蛋白的摩尔数(pmol) 较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从而影响鉴定的成功率。
5. 为什么我的MALDI 图谱中都是相差44Da 的峰，肽段的峰则全被抑制了？相差44Da 的峰可能是Triton X 峰，也可能是polymer （-CH2CHOH- ）峰。
这些polymer 是从EP 管的内壁沥滤（leaching ）出来的。
所以样品中不能含有Triton X 。