免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化 protocol 方法与原理大全
免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)准备：60℃ 烘片2-4h1. 二甲苯脱蜡1 30min2. 二甲苯脱蜡2 30min3. 100% 乙醇 10min 2次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。
可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中9. 3%H 202孵育10min （200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天(3h)12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）14.PBS 3min 3次15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
免疫组织化学染色SP技术课件
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
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具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
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染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
免疫组化SP方法
免疫组化实验方法免疫组化步骤：1、取材：取实验组和对照组动物组织尽可能新鲜，PBS洗，取小于0.5cm×0.5cm×0.1cm组织块；2、固定和包埋：用4%多聚甲醛进行固定，经70%乙醇30分钟、80%乙醇30分钟、90%乙醇30分钟两次、95%乙醇30分钟两次、100%乙醇30分钟两次、二甲苯透明15分钟两次、55℃石蜡中1小时三次，用不锈钢模具包埋组织块；3、切片：将厚度5um的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；4、脱蜡、入水：将切片浸于二甲苯中5分钟两次、100%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、90%乙醇5分钟两次、85%乙醇5分钟次、70%乙醇5分钟两次，自来水冲洗，PBS洗两次；5、抗原修复:柠檬酸缓冲液，热修复20分钟， PBS洗3次×5分钟；6、3%双氧水,室温10分钟, PBS洗3次×5分钟；7、切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
甩去多余液体，不洗；8、切片上滴加第一抗体，4℃过夜，PBS洗3次×5分钟；9、切片上滴加生物素化第二抗体（IgG），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；10、切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分钟，PBS洗3次×5分钟；11、DAB显色：使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6分钟，充分水洗；12、复染：苏木素1分钟，充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝，充分水洗；13、封片：经70%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、90%乙醇5分钟两次、95%乙醇5分钟两次、100%乙醇5分钟两次脱水、二甲苯透明5分钟两次、中性树脂封片；14、显微镜观察：选择实验组和对照组的阳性组织相、进行400×的显微照相。
15、图像分析：选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘。
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10 min→二甲苯Ⅱ5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。
6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min，PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，用于检测组织切片中特定抗原的分布和表达水平。
它结合了免疫学和组织学的原理，能够在组织切片上定位和检测抗原，并通过染色方法将抗原可视化，从而实现对抗原的定性和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括固定、脱脂、抗原修复、抗体和检测步骤。
下面将详细介绍每个步骤的操作和常用试剂。
1.组织固定：组织固定的目的是保持组织结构完整并固定细胞的抗原。
常用的固定试剂包括10%中性缓冲福尔马林（10% neutral buffered formalin，NBF）和乙醇等。
2.脱脂：脱脂是将组织切片中的脂质去除，以提高抗体对抗原的结合效率。
常用的脱脂试剂包括二甲苯、甲醛和乙醚等。
3.抗原修复：抗原修复是为了使被固定的组织恢复原样，增强抗原的可检测性。
抗原修复的方法包括热处理、酶解法和pH调整等。
常用的抗原修复试剂包括热解剂例如EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液，酶解剂例如胰蛋白酶和蛋白酶K，以及甲酸、盐酸等酸性溶液。
4.抗体：5.检测：检测步骤用于将抗原-抗体复合物可视化。
这通常通过染色方法完成。
常用的染色方法包括免疫酶标记、免疫荧光和免疫金标记等。
免疫组化实验所需的试剂种类繁多，下面列举一些常用的试剂：1. NBF（10% neutral buffered formalin）：用于组织固定，保持组织形态完整。
2.二甲苯：用于脱脂步骤，去除组织中的脂质。
3.甲醛：用于脱脂步骤。
4.乙醚：用于脱脂步骤。
5.EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
6. Tris-EDTA缓冲液：用于抗原修复的热解剂。
7.胰蛋白酶：用于抗原修复的酶解剂。
8.蛋白酶K：用于抗原修复的酶解剂。
9.盐酸：用于抗原修复的酸性溶液。
10.一抗：选择特异性良好的一抗抗体，常用的有多克隆和单克隆抗体。
11.二抗：用于检测一抗结合的抗体，常用的二抗有反兔、反小鼠或反人的多克隆抗体。
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫组化 protocol 方法与原理大全
免疫组化（SP 法） 第一天 (5h)准备：60℃ 烘片2-4h1. 二甲苯脱蜡1 30min2. 二甲苯脱蜡2 30min3. 100% 乙醇 10min 2次4. 95% 乙醇 3min5. 85% 乙醇 3min6. 75% 乙醇 3min7. ddH 20 1min 2次 轻晃以防掉片8. 抗原修复：使用1L 烧杯，9ml 柠檬酸（0.1M 现配）溶液和41ml 柠檬酸钠（0.1M ）加450ml ddH 20（ph=6）罩上锡纸，封烧杯口，扎洞若干，煮沸20min （可先煮沸再放片子，也可以先放片子再一起煮，温度先调至420℃多，煮沸后调到250℃左右，计时15-20min ）之后自然冷却（30-40℃） 9ml 柠檬酸配法：9ml ddH 20加0.18g 柠檬酸。
可以直接称取0.18g 柠檬酸加41ml 柠檬酸钠加450ml 水0.1M 柠檬酸钠配法：29.41g 柠檬酸钠加入1L 蒸馏水中，或14.7g 加入500ml 蒸馏水中9. 3%H 202孵育10min （200ml，盒子装，现配，用甲醇稀释30%H 202至3%H202）以消除内源性过氧化物酶活性（内源性过氧化物酶能与HRP 反应，造成假阳性），PBS 冲洗3min 3次10. 加试剂A （山羊血清，起到封闭作用）一滴（蓝色）室温孵育10-15min 盖盖防干，倾去勿洗，先甩再擦（试剂A,B,C 放在1号冰箱侧门，擦干玻片，放在湿盒里，盒子两侧不要放玻片，以防接触到盒壁，抗体流出，要求试剂刚好覆盖组织，全部滴完计时10min ，用黄枪头抹匀试剂）11. 加一抗，4℃过夜，25-50ul 每个组织，一抗用PBS 稀释，4℃放置，加完一抗后，先不要盖盖，放到冰箱里后再盖盖第二天(3h)12.PBS 3min 3次（将1xPBS倒进盒子里，里面放架子，片子甩干后放进架子里）13.加试剂B（黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂B是生物素化的二抗，能与一抗结合）14.PBS 3min 3次15.加试剂C（橙黄色）室温孵育10-15min，盖盖（试剂C是HRP标记的链霉亲和素，一个亲和素可以与四个生物素非共价键结合，不可逆，结合紧密。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。
它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等、三、试剂配制1、0。
01M PBS(ｐH 7.34 ):9.０g ＮａCl + ５0 mｌ０.2 M PB加双蒸水至１0０0ml;１000 mｌ0。
２M PB(ｐH7、4)＝5。
93 ｇＮaH２ＰＯ4 ·2Ｈ2 O+５8。
０2 g Na ２HPO 4 ·１2Ｈ 2 O in １000 ｍl双蒸水或=190ml A +810 ml B(A、０、2ＭＮaH 2 ＰO 4 ·2H ２O:15。
6 ｇｉn 500ml ddH 2 O;Ｂ。
０、2ＭNa 2 ＨPＯ 4 ·12H 2 O:７1、６32ｇin 1000 ｍl ｄH 2 O)。
2. Ｃｉｔrate Buｆfered Saliｎe(０。
01 M 柠檬酸缓冲液,PＨ6.０):28 ml A + 72 mｌB + ２00 mｌｄdＨ２Ｏ(Ａ。
Cｉtｒate aciｄ(柠檬酸):10.５g 加双蒸水至1０00ml;Ｂ。
C ｉtrate sodｉum(柠檬酸钠):29。
41 g 加双蒸水至1000 ml)、３、细胞通透液:由终浓度分别为0.3％双氧水与0、３%Trｉton X－100 混合而成。
配制方法就是先用微波加热得36ｍｌPBS,再接着加120 ｕｌＴritonＸ－10０,并加热一儿,冷却至临用前加0。
４ｍl 30％H 2 O 2 。
SP法免疫组化的步骤
操作步骤：
1．石蜡切片逐步脱蜡至水，PBS（0.01M，pH7.5）冲洗3次，每次3分钟。
2．抗原修复，以0.01M（pH6.0）柠檬酸盐缓冲液高压修复3分钟，自然冷却至室温；PBS 冲洗3次，每次3分钟。
3．除去PBS液，每张切片加50ul3%H2O2去离子水（无色液体），室温下孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS冲洗3次，每次3分钟。
4．除去PBS液，每张切片加50ul试剂A（蓝色液体：封闭用正常山羊血清工作液），室温下孵育15分钟，倾去，勿洗。
5．滴加按1:100比例稀释的一抗，37℃孵育2-3小时或4℃过夜。
6．PBS液冲洗3次，每次5分钟。
7．每张切片滴加50ul试剂B（黄色液体：生物素化二抗工作液），室温下孵育10分钟，PBS 冲洗3次，每次5分钟。
8．除去PBS液，每张切片滴加50ul试剂C（橙色液体：辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。
（最后两次冲洗期间配DAB溶液：在试管中先加入1ml 1xHRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A50ul、试剂B50ul混匀即可，避光存放，30分钟内有效使用。
）
9．除去PBS液，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察，显色5-15秒。
10．自来水终止显色，苏木素复染10秒钟，自来水冲洗返蓝2分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
11．应用HPIAS-1000H高清晰度彩色病理图像测量系统（版本：6.0）进行图像分析。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤实验原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。
先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
实验步骤：（一）脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1、组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。
2、无水乙醇中浸泡五分钟。
3、95%乙醇中浸泡五分钟。
4、75%乙醇中浸泡五分钟。
（二）抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：1、抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。
盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。
ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等2、酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
免疫组化相关问题-个人总结
一般的sp法步骤啊，具体如下：1、烤片，68℃，20分钟，2. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.3. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2-甲醇溶液浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
4. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS 中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。
血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
5. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，不洗，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。
加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜(≥18h)。
6. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，4℃过夜后在37℃复温45分钟，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
7. 加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS 后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。
SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
8. 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
免疫组化sp法
免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。
相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。
本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。
原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。
HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。
而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。
SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。
实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。
可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。
2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。
使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。
3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。
4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。
5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。
根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。
6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。
在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。
7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。
AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。
8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。
9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。
实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。
2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。
免疫组化染色SP法
免疫组化SP法一．实验原理SP法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。
链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000.同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。
亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。
链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。
根据研究，SP大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。
大量的酶将保证SP具有很高的敏感性。
SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。
二．试剂来源三．操作步骤1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min 以使切片紧密粘附。
2．切片常规脱蜡3．30%过氧化氢1份+蒸馏水10份混合，室温10min以灭活内源性酶。
蒸馏水洗3次4．热修复抗原：将切片浸入0.01M 构橼酸盐缓冲液（PH6.0），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。
5．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗6．滴加一抗（1:300）4℃过夜。
PBS（PH7.2~7.6）洗2min，共洗三次。
7．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100），37℃30min。
PBS （PH7.2~7.6）洗2min，共洗3次。
8．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100）PBS（PH7.2~7.6）洗5min，共4次。
9．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。
取1ml蒸馏水，加设计盒中A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。
室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min之间，蒸馏水洗涤。
10．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察。
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免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生岀了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。
3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。
胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。
因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。
如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法5、放射免疫自显影法标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（I）、（H）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（I）、（U）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58 C）45min，石蜡（I）、（H）、（山）共2.5h，用石蜡（山）包埋组织5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 gm，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50 C温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCI浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 -涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68 C恒温箱内烤片2h②SP三步法1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60 C恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（I）、（且）浸泡，共25min2、水化：无水酒精（I）、（U）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（I）（U）各2min3、PBS冲洗2-3次，每次5min4、阻断：3%H 2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0 ）中用煮沸（95 C，15-20min ），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温7、PBS冲洗2-3次，每次5min8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体9、滴加I抗50讪，室温静置1h，或者37 C 1h，或者4 C过夜（需在37 C复温45min ）10、P BS冲洗2-3次，每次5min11、滴加辣根过氧化物酶标记的H抗40〜50 g，室温静置1h，或37 C 1h12、P BS冲洗2-3次，每次5min13、滴加SP （链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37 C孵育30min-1h14、P BS冲洗2-3次，每次5min15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B,摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀）（A : DAB B：H2O2 C:磷酸缓冲液）16、自来水冲洗10分钟终止反应17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化18、自来水冲洗10-15min19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X ），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
试剂、设备：1、PBS : 0.01M 磷酸盐缓冲液（pH7.4）配制--取NaCI 8g ，KCI 0.2g，Na2HPO 4?12H 2O 3.63g 或Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml 双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
2、固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH7.4）配制-a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500mlA 液：0.1mol/L Na 2HPO4 （Na 2HPO 4?12H 20 35.8g 加水定容至1000ml ）B 液：0.1mol/L NaH 2PO4 （NaH 2PO 4?2H 2O 15.6g 加水定容至1000ml ）b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M 磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-3h后溶解3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%4、二甲苯5、包埋剂：石蜡6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml ）、APES （3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）7、抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液（PH 6.0 ），或0.01M 柠檬酸盐缓冲液（pH6.0 ）配制--取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml，调pH于6.0，再定容至500mlA 液：0.1mol/L 柠檬酸（C6H8O7?H2O 21.01g 加水定容至1000ml ）B 液：0.1mol/L 柠檬酸钠（Na 3C6H5O7?2H2O 29.41g 加水定容至1000ml ）8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）试剂A --阻断剂：3%甲醇-H 2O2溶液（30%H 2O2和80%甲醇溶液配制）试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）试剂D -- SP （链霉亲和素-过氧化物酶）9、一抗（特异结合底物）10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统附：EDTA (乙二胺四乙酸)：即依地酸钠钙，是钙离子络合剂、洗涤剂、血液抗凝剂常用固定液1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
(1)3% 中性甲醛固定液液：30% 甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml(2)24%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml ，加热搅拌(注意不要沸腾)至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml(3)戊二醛—多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1 %的戊二醛(4)Bouin液：40 %甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.(5)PLP液(过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液)2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀(1)AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml(2)Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml多用于冰冻切片的后固定(3)Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存(4)丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在 4 °C冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5~ 10min3、其他固定剂(1) Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测(2 )四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因： a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；b.甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复(1)高压热修复：在沸水中加入0.5mol/L EDTA 缓冲液(pH8.0 )或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )至95 C左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
(3)微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0 )至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos ，X-jun ，C-kit ，C-myc ，E-cadherin ，Chromogranin A ，Cyclin ，ER，Heat shockprotein ，HPV，Ki-67，MDMZ ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein ，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase U 等。