Neon 细胞电转仪中文说明书(MPK5000)

一，简单的3步骤程序。

1.将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA，RNA，siRNA）的混合物加入到提取物中。

2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中; 在设备上选择程序，然后按开始。

3.拔下移液器，将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。

注：1.为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA / siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液2.为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次

二，软件操作程序

1.按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon®设备。本机检查确保Neon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。

2.按Voltage启动数字键盘输入电压值。按所需的电压值，然后按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。

3.按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。

4.按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值，然

后按Done保存该值。

5.如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。

6.按所需的程序号码编辑程序。选定的程序会突出显示。

7.显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width 和Pulses信息。

8。按Enter键将信息保存在数据库中。

9.继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座

三，细胞与DNA混合物准备

注意事项：

1.将纯化的DNA重悬于1-5μg/μL浓度的去离子水或TE缓冲液（10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH8.0）中。浓度可能因细胞类型而异。

2.DNA量不应超过使用总体积的10％。

3.通过测量A 260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。电穿孔的比例应至少为1.8。

4.该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。使用大于20 kb的质粒很可能降低转染效率。

5.不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。通过乙醇沉淀的浓缩DNA 显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。

6.不含Ca2 +和Mg2 +的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）

流程：

1.用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和Buffer E2，100μLNeon®Tip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。）

2. 将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。

确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）

3.在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。

4.对于大多数优化协议，每10μLNeon®Tip可提供5×104-2×105个细胞。（5×105-2×106个细胞每100μLNeon®Tip适用于大多数优化的方案。）

5.将含有血清，PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）和胰蛋白酶/ EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37℃。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/ EDTA 或TrypLE Express（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400×g离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400×g离心5分钟，用PBS（不含Ca2 +和Mg2 +）清洗细胞。吸出PBS并以1.0×10 7个细胞/ mL的最终密度将细胞沉淀重悬于Resuspension Buffer R中。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。

6.通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37℃/ 5％CO 2培养箱中预培养板。如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。

7.对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA

的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液

8.使用3 mL电解缓冲液（使用缓冲液E，10μLNeon®Tip和缓冲液E2，100μLNeon®Tip）装入Neon®移液管

9.根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件

10.将适量的质粒DNA / siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。

11.将细胞加入到含有质粒DNA / siRNA的管中，轻轻混合。请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。

12.要将Neon®Tip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具

13.将Neon®移液器的顶部插入Neon®Tip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）

14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。注意：确保Neon®移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接

15.将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA / siRNA混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA / siRNA混合物吸入Neon®Tip。

在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。

16.将带有样品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至听到咔嗒声。确保移液器突起插入吸液管的槽中。