基因编辑技术

基因编辑技术（近十年出现）:可以帮助科研人员对各种细胞 和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作 《ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering》
1、在不同人种之间，自由“切换”
2014年3月12日，宾夕法尼亚大学Pablo Tebas教授团队在新英格兰医学 杂志撰文称，他们利用Sangamo BioSciences开发的ZFNs基因编辑技术， 显著提高了艾滋病患者对艾滋病毒的抵抗能力。
CRISPR/Cas系统
CRISPR/Cas 系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割主 要依赖于crRNA 与Cas 蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM 以及 protospacer ． 根据CRISPR/Cas 系统这一特性，将其用于设计人工的核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，用来对我们感兴趣的基因位点进行修饰． 三类 CRISPR/Cas 系统中TypeⅡ型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA 和 tracrRNA 外，只有Cas9 一个蛋白．目前，产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶。
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ZFN： Cys2–His2锌指蛋白
图A：一个锌指大约由30个氨基酸组成，形成了一种 保守的ββɑ结构。在锌指ɑ螺旋结构表面的那几个氨基酸 能够与DNA大沟上的3个碱基结合，不过这种结合的选 择性会有所差异。 因为有了高度保守的链接序列，我们 就可以设计出能够识别9~18个碱基长度的DNA序列。在 一段 680亿个碱基组成的DNA序列里，18个碱基组成的 序列就足以成为一段特异性的序列，所以如果能够设计 出含有3种以上的锌指蛋白DNA识别结构域的蛋白，那么 就意味着科学家们能够利用锌指蛋白识别出人类基因组 里的任意一段DNA序列。
1）基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生 DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。
2）特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个 含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率， 从而实现特异突变的引入。 3）定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过 程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。
二、什么是基因组编辑技术
• 所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列 进行删除和插入等操作，换句话说，基因 编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改 写DNA这本由脱氧核苷酸书写而成的生命之 书。
基因编辑技术的原理
• 构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切 断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系 统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造 基因组的目的。 • DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链 断裂（double-strand break, DSB）,即非同源末 端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和 同源重组（homologous recombination, HR）。 通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实 现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异 突变的引入和定点转基因
CRISPR/Cas的基因座结构
其基因座结构可分为三部分：5‘ 端为tracrRNA 基因，中间为一系列Cas 蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn2，3’ 端为CRISPR 基因座， 由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺 序排列组成。
3、“恢复”受损基因，才能重见光明 2015年11月3日，Katrine Bosley在剑桥大学召开的EmTech大会上宣布，实验 室数据表明，CRISPR基因编辑技术可以用于治疗Leber congenital amaurosis （LCA；利伯先天性黑朦病，一种遗传性视力衰退疾病），Editas将在2017年 开展CRISPR基因编辑人体实验。
Editas的CEO Katrine Bosley Editas宣布的2017年人体实验激动人心之处在于，这有可能是首次体内（in vivo） 基因编辑试验。这项研究成功的意义在于，将CRISPR基因编辑“工具”装载到 病毒体内，再把病毒注射到患处，CRISPR可以自行对患病部位进行基因改造。 那么以后治疗Layla那样的白血病，不用分离T细胞了，直接将改造好的病毒注 射到骨髓，就直接将基因异常的骨髓修复了，或者是直接整合目标基因加强其 战斗力。这样一来，很多大手术就会变成微创手术，带来的好处是难以估量的。
三、基因编辑技术的分类
• 第一代人工核酸内切酶：锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大 约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶Fok I融合形 成的核酸内切酶，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA 的双链切口。 • 第二代人工核酸内切酶：类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。 TALEN可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较 为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。2012年， TALEN被《科学》杂志评为十大科学突破之一。 • 第三代人工核酸内切酶：规律间隔成簇短回文重复序列-Cas蛋白 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，主要是基于细菌的一种获得性免疫 系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。
CRISPR/Cas的作用机理（分为三个阶段来理解）：
PhaseⅠ
PhaseⅡ
PhaseⅢ
第一，CRISPR的高度可变间隔区的获得
噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer，通常protospacer 的5‘ 或是3’ 端延伸几个碱基序 列很保守，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2～5碱基，一般与protospacer 相隔1～4 碱基．新间隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA 潜在的PAM，将临近PAM 的序 列作为候选protospacer；然后在CRISPR 基因座的5‘端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列 之间(图2)。目前只有第一个步骤被证实。
2、“关闭”一个基因，打开生命之门 2015年11月5日，Waseem Qasim对外宣布，他们利用Cellectis公司经TALENs基 因编辑技术改造的UCART19细胞株，成功缓解了Layla的不治之症--急性淋巴细 胞性白血病（ALL），造就了世界首例婴儿白血病治疗奇迹，是基因编辑技术 有史以来第二次被运用在人体上技术。
第三，是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰：成熟的 crRNA 与特异的Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描 到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA 的间隔序列与靶序列互补配对，外 源DNA 在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为crRNA的 间隔序列(spacer)与外源DNA 的靶位点完全互补配对对于切割是必需的，但 是后来的研究证明spacer 与protospacer 部分互补配对时切割也可以发生。
利用同源重组机制对基因进行定向失 活是为基因功能评估提供信息的有力 手段。但是这一技术的应用有几个限 制因素，包括遗传工程组件插入目标 位点的效率低、筛选过程费时费力、 有可能产生不利的突变效应等。
RNAi基因靶向敲除技术给研究者提供了快捷、 廉价而且可以开展高通量研究的新方法，但 是， RNAi的基因敲除效果还不够彻底，每次 试验以及每个实验室的试验结果都会有差异， 另外还存在不可预知的脱靶情况，所以只能 够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中。
图B：锌指核酸酶二聚体与 DNA结合示意图。 锌指核酸酶的靶序列含有两个锌指蛋白结合 位点，不过这两个位点之间还有一段5~7bp 的间隔序列，锌指核酸酶里的Fok I酶切结构 域就能够切割这段间隔序列。当然，我们也 可以设计出只能够识别左侧或者右侧结合位 点的锌指蛋白。
TALEN
TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33~35个氨基酸组成的重复结构域组 成的，其中每一个结构域都能够识别一对碱基。TALE核酸酶的DNA结合特异性主 要由两个高度可变的氨基酸决定，科学家们将这两个关键的氨基酸称作重复可变 双氨基酸残基位点（repeat-variable di-residues, RVD）。 与锌指结构域一样，这种TALE重复模块也能够串联起来，识别一长串的DNA序 列。 TALEN分子比ZFN大得多，因此很难高效导入，科学家们也想出了不少的办 法，如金门分子克隆技术（‘Golden Gate’molecular cloning） 。
基因编辑技术
产生背景 定义及原理 分类及比较 CRISPR的优点及在植物育种上的应用 CRISPR基因编辑技术的一般操作程序
一、基因编辑技术的产生背景
全基因组测序技术的不断发展和完善 基因革命（基础科学与个 性化医疗之间进行转化） 大型基因组注释项目的实现 将大量数据转化为功 能和临床相关知识
解决这个问题最核心的是需要有高效、可靠的 方法使研究者能够知道基因型如何影响表型
免疫细胞表面的CCR5蛋白 是HIV进入免疫细胞的“入 口”。而少数北欧人由于 CCR5基因“变异”（来源 于原始高加索人），具备 天然的HIV抵抗力。 “要不把患者的CCR5基因 都改成高加索人种那种类 型吧”！
基因编辑技术首次应用于临床。目前Sangamo BioSciences基于ZFNs技术治疗 艾滋病的方法已经进入临床II期试验。
修改捐赠细胞使其抗癌：蕾拉的生命获救得益于基因工程修改过的血液细胞。捐 赠的血液细胞来自美国，科学家总共对其进行了三次修改。科学家们首先在捐赠的 血液细胞中添加抗白血病基因，这些基因可编码靶向并杀死癌细胞的蛋白质，其次 科学家使用TALENs技术关闭两个基因，关闭第一个基因是为了确保捐赠的细胞不被 蕾拉的身体排斥，关闭第二个基因是为了确保捐赠细胞不被治疗药物杀死。 http://opinion.haiwainet.cn/n/2015/1113/c345416-29353992.html http://www.jiemian.com/article/435551.html
• 第二，CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）：多个研 究表明CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在 Cas 蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 单元，这些小 RNA 即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成， TypeⅡ型 CRISPR/Cas系统crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNaseⅢ参与以外，还需要 tracrRNA的指导 ；
2013年
Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, Carlos F. Barbas. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 09 May 2013; DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.004