CRISPR_Cas9 基因编辑技术简介

4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后， 形成crRNA-Cas蛋白复合体， 通过碱基互补配对精确地 与目标DNA相结合，随后 Cas蛋白对目标DNA 进行断 裂和降解。
6.降低脱靶效应
添加同源臂(homology arm,HR)
Yu Hisano et al.2014
6.降低脱靶效应
FoKI-dCas9
Nicolas Wyvekens et al.2015
6.降低脱靶效应
CRISPR/Cpf1系统
Cpf1系统更简单一些，它只需要一条 RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小， 使得它更易于传送至细胞和组织内。
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著 名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、 小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒 中至少存在CRISPR 基因座。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.3Cas家族：
Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链 DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与 fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
3.CRISPR/Cas9系统作用机制
4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: E-CRISPR: ZiFiT: Cas9 Design: .cbi.pku.edu.cn/index.jsp Cas-OFFinder: CCTop:
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和Hቤተ መጻሕፍቲ ባይዱH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分 为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统 需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9 免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是 被改造的最成功的人工核酸内切酶。
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
2.CRISPR/Cas系统结构
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因敲除或者敲入； 基因修复； 基因调控； 文库筛选。
5.CRISPR/Cas9 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。 Cas9切割留下“平端”（blunt ends）。
Cpf1复合物生成的两条链切口是偏 移的，在裸露端留下了短悬端 （overhang）。这预计有助于精确 插入。