大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定

学 研 究 及 采 用 免 疫 荧 光 和 免 疫 组 织 化 学 法 测 定 两 种 细 胞 α-actin 蛋 白 和 Desmin 蛋 白 的 表 达 及 分 布 ，从 而 对 骨 骼 肌 卫
星细胞进行鉴定。 结果 通过组织块培养法获取的细胞增殖旺盛，分化良好。 免疫细胞荧光和免疫组织化学实验结果
广东 广州 510080）
摘 要 ： 目 的 采 用 组 织 块 培 养 技 术 探 索 大 鼠 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 的 原 代 培 养 方 法 。 方 法 以 成 年 SPF 级 Sprague-Dawley
大 鼠 为 研 究 对 象 ，采 用 组 织 块 培 养 法 获 取 大 鼠 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 ，并 与 C2C12 成 肌 细 胞 进 行 比 较 ，对 两 种 细 胞 进 行 形 态
中 图 分 类 号 ：R394．2
文献标识码： A
文 章 编 号 ：1672-3619 （2011）04-0395-03
Cultivation and identification of rat skeletal muscle satellite cells
CHEN Si-fan1，2，LI Wen-xue1，CHEN Jian-ling1，2，YANG Guang-yu1，LIU Hua-zhang1，ZHU Wei1 （1．Guangzhou Center for Disease Control and Prevention， Guangdong，Guangzhou 510080； 2．School of Public Health，Sun Yat-sen University， Guangdong，Guangzhou 510080，China）
体外实验研究常采用原代分离培养的细胞。 目 前分离原代骨骼肌卫星细胞的方法多为酶消化法。 酶消化法步骤较为繁琐， 且如果酶作用时间不足则 获得细胞较少，作用时间过长则可致细胞受损、生长
基 金 项 目 ：广 州 市 科 技 计 划 项 目 （2009Z1-E061） 作 者 简 介 ：陈 思 凡 （1984－），男 ，硕 士 研 究 生 ，研 究 方 向 为 植 物 源 性 生
热带医学杂志 2011 年 4 月第 11 卷第 4 期 J Trop Med，Apr． 2011，Vol．11，No．4
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·硕 博 专 栏 论 著·
大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养和鉴定
陈思凡 1，2，李文 学 1，陈建玲 1，2，杨 光宇 1，刘华章 1，朱伟 1 （1．广州市疾病预防控制中心，广东 广州 510080；2．中山大学公共卫生学院，
Abstract：Objective To explore the primary culture method of skeletal muscle satellite cells． Methods Skeletal muscle satellite cells were obtained from the specific pathogen free Sprague-Dawley rats ，and C2C12 myoblast cell line was used as control．The cellular morphology was observed and photographed under an inverted microscope． The expression of α-actin and desmin was assayed with immunofluorescence and immunohistochemical staining method ，respectively．．Results The morphological feature of primary cultured skeletal muscle satellite cells was similar with the myoblast C2C12 cell line． Immunofluorescence and immunohistochemistry staining showed that the pattern of α-actin and desmin protein staining in the cytoplasm of skeletal muscle satellite cells was similar to C2C12． Conclusion Skeletal muscle satellite cells can be obtained using the tissue culture method． Key words： skeletal muscle ssatellite cells； tissue culture； desmin
显 示 ，α-actin 蛋 白 和 Desmin 蛋 白 在 两 种 细 胞 胞 浆 中 均 有 分 布 。 结 论 用 组 织 块 培 养 法 获 取 的 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 具 有 良
好的增殖与分化能力，用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌卫星细胞。
关 键 词 ：骨 骼 肌 卫 星 细 胞 ；组 织 块 培 养 技 术 ；Desmin 蛋 白
骨骼肌卫星细胞是机体骨骼肌组织中未分化的 细胞，位于骨骼肌细胞基底膜与肌纤维浆膜之间，是 源于胚胎中胚层的干细胞［1］。 在 正 常 状 态 下 处 于 静 止期， 受外界刺激时或在应激状态下可以分裂、增 生，并可融合成多核细胞及形成新的肌纤维。研究表 明，骨骼肌受创伤后及肌纤维再生和修复过程中卫 星 细 胞 发 挥 了 重 要 的 生 物 学 作 用 ［2］。
1 材料与方法
1．1 材 料 高 糖 DMEM 培 养 基 和 胎 牛 血 清 购 自 美 国 Gibco 公 司 ；Poly-D-lysine 溶 液 购 自 江 苏 Beyotime 公 司 ；DAPI 荧 光 染 料 购 自 美 国 Sigma 公 司 ；兔 抗 αactin 单克 隆 抗 体 和 兔 抗 Desmin 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国 CST 公司；山羊抗兔二抗（绿色荧光标记）购自 美 国 Invitrogen 公司；SABC 免疫组化试剂盒和 DAB 显 色试剂盒由武汉 Boster 公司提供；C2C12 细胞株购自 中国上海科学院细胞生物研究所；SPF 级 SD 大鼠由
制反应时间。苏木素轻度复染，脱水，透明，在光学显 微镜下观察并拍照。 1．3 统计分析
实验计量数据用 （x ± s） 表示， 数据录入 SPSS 11．0 统计学软件。
2结果
2．1 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 的 培 养 将 体 积 约 为 1 ～3 mm3 的组织碎块贴附于 6 孔板底部，相隔适宜间距， 培养过夜后可见组织块的细胞开始贴壁， 培养 2 d 后细胞从肌小粒边缘爬出， 培养 4 d 后爬出的细胞 逐渐增加（如箭头所示），此时细胞仍未完全伸展，细 胞为圆形或类圆形（图 1）。 8～10 d 后细胞铺满孔底 面 积 约 80％ ， 按 照 差 速 贴 壁 的 方 法 去 除 成 纤 维 细 胞，将骨骼肌卫星细胞接种于 6 孔板，过夜后可见细 胞完全贴壁，细胞为梭形或纺锤形，增殖 2 d 或 4 d 后 ，细 胞 的 密 度 明 显 升 高 ，以C2C12 细胞对比，可见 培养的卫星细胞与其形态相似（图 2）。 将血清浓度 降低至 2％后，培养 24 h，骨 骼 肌 卫 星 细 胞 和 C2C12 细胞都可融合成多核肌管，呈竹节样，肌管间大多呈 平行排列。 2．2 细胞的生长 曲 线 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 在 接 种 培 养 3 d 后进入对数生长期，6～8 d 后细胞的生长速度 明显减慢， 而 C2C12 细胞在接种 2 d 后进入对数生 长期，5 d 后开始减缓生长（图 3）。
物活性物质 通 讯 作 者 ： 刘 华 章 ， 男 ， 主 任 技 师 ，E-mail：huazhliu＠126．com； 朱 伟 ，
男 ，博士 ，副主任医师 ，E-mail：zhuyc126＠126．com
状态不佳。为避免酶消化法的缺点，采用组织块培养 法对大鼠骨骼肌卫星细胞进行分离培养， 并检测在 骨 骼 横 纹 肌 组 织 中 广 泛 表 达 的 α-actin 蛋 白 及 肌 纤 维所特有的 Desmin 蛋白的表达及分布，旨在摸索和 建立一种更加简便、完善的骨骼肌卫星细胞培养方 法，为进行外源性化合物对骨骼肌损伤作用等方面 的研究提供更好的细胞模型。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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广东省医学实验动物中心提供，合格证号：0063679。 1．2 实验方法 1．2．1 大 鼠 骨 骼 肌 卫 星 细 胞 的 分 离 及 培 养 选 择 160～180 g 的 SD 大 鼠 ，CO2 麻 醉 处 死 后 浸 泡 于 75％ 乙醇溶液进行皮肤表面消毒，解剖并无菌分离后肢 部肌肉并去除筋膜、血管及脂肪组织后，用眼科剪将 肌肉块剪成约 1 mm3 大小，PBS 冲洗，吹打，静置 1 min， 弃去漂浮物及液体。 将肌肉碎片小心贴附于 6 孔板 的 孔 底 部 ，每 孔 加 入 300 μl DMEM 培 养 基 （10％ 胎 牛血清、100 IU ／ ml 青霉素、100 IU ／ ml 链霉素），置入 培养箱中，于 37℃、5％ CO2、95％湿 度 的 条 件下培养 4 h 后取出 6 孔板，每孔添加培养基至 2 ml，置 入 培 养箱继续细胞培养，每 2 d 更换 1 次培养基。 待细胞 从组织块边缘爬出并铺 满 孔 底 面 积 约 80％时 ，弃 掉 组织块，用 0．25％胰蛋白酶消化细胞，按照适宜密度 接 种 细 胞 于 预 包 被 Poly-D-lysine （ 包 被 浓 度 为 0．1 mg ／ ml）的培养瓶中，按照差速贴壁的原 理 去 除 成 纤 维细胞，即细胞培养 2 h 后取出培养基，转移至另 一包被培养瓶中，置入培养箱进行细胞培养。用于比 较的 C2C12 细胞应为 5～10 代，细胞培养方法同卫星 细胞。 1．2．2 细胞生长曲线 取传至第 2 代的骨骼肌卫星 细胞 和 第 5 代 的 C2C12 细 胞 ，用 0．25％的 胰 蛋 白 酶 进行消化，按照 3×104 ／ ml 的密度接种于 24 孔板，每 孔 500 μl，每天取 3 孔消化后，进行细胞计数，共 8 d。 根据计数结果用 Excel 绘制细胞生长曲线。 1．2．3 免疫荧光实验［3］ 两种细胞均接种于 激 光 共 聚 焦 实 验 的 专 用 皿 中 ， 培 养 过 夜 ， 去 除 培 养 基 ， 用 PBS 洗涤 1 次，在室温用 4％的多聚甲醛溶液固定 20 min， 用 0．1％ Triton X-100 进 行 细 胞 增 透 处 理 15 min， 3％ BSA 溶 液 进 行 封 闭 作 用 30 min，添 加 抗 α-actin 一抗（1∶200）于 4℃过夜，PBS 洗涤 1 次，添加绿色荧 光 标 记 的 二 抗 （1∶500）， 室 温 作 用 1 h，PBS 洗 涤 2 次 ， 细 胞 用 DAPI 溶 液 （0．5 mg ／ ml） 染 细 胞 核 1min， PBS 洗涤 1 次，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。 1．2．4 免疫组化实验［4］ 两种细胞均接种于 预 包 被 Poly-D-lysine 的 24 孔板中培养 2 d，去除培 养 基 ，用 PBS 洗涤 1 次， 在室温用 4％多聚甲醛溶液固定 30 min，PBS 清 洗 1 次 ，30％H2O2∶ 甲 醇 （1∶50） 室 温 孵 育 30 min 以 灭 活 内 源 性 过 氧 化 物 酶 ，PBS 清 洗 2 次 后 用 5％ BSA 溶液进行封闭， 去除多余液体， 添加抗 Desmin 抗体（1∶200）于 4℃过夜，PBS 洗涤 2 次，滴加 生物素化山羊 抗 兔 IgG，室 温 作 用 30 min，PBS 清 洗 3 次 ，滴 加 试 剂 SABC，室 温 作 用 20 min，PBS 清 洗 4 次。 取 1ml 蒸馏水，加 DAB 试剂盒中 A、B、C 试剂各 1 滴，混匀后加至细胞孔中，室温显色，显微镜下控