酶免检测技术原理及影响分析
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酶免检测技术原理及影响因素
检验科 孙文鲜
3月18日免疫室差错问题分析及整改措施
3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大 吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题 ，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背 了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗 旨。 针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施： 1、端正态度、要认真、负责 2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本 标记清楚 3、增加人员缓解紧张工作状态
原理： 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应 酶对底物的显色反 应 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
二、酶联免疫吸附试验
1、基本原理
原理
.
1
包被 洗涤
反应
2
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
四、ELISA法检测注意事项 五、ELISA法检测常见问题及解决方法
一、抗原抗体反应
抗原抗体反应原理
抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化 学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体 超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。 有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。
现象
可能原因
1、试剂盒未平衡至室温
2、水浴箱温度不到37℃
解决方法
实验前试剂盒置于室温平衡30分钟 以上
调整水浴箱温度至37℃ 孵育期间不宜多开门 校准定时钟、准确定时 校准吸液器 吸嘴与移液器接合紧密 吸嘴一次性使用 瓶身应垂直滴加，保证液滴最大
显 色 淡
3、孵育时间不够 4、样品加样量偏少 5、酶结合物加样量偏少
激素等）
方法类型及反应原理
双抗原夹心法（测抗体）
原理：类似双抗体夹心法
.
操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体
方法类型及反应原理
间接法（测抗体）
方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗
人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的
不溢孔，残留<5ul 洗板后拍干，封板纸 不能重复使用
6、显
色
检查底物溶液的有效性；
试剂显色时先加A液，
后加B液，二者不要颠倒。
前后加入的间隔时间
不超过10分钟，不漏加。
A、B液应避免接触污染物。 不同厂家、批次酶显色液 不得混用
7、终止和读数
肉眼判断不准确，影响结果 酶标仪的波长选择的问题。 加完终止液后30分钟内读取数据。 保证酶标板的底部是清洁干燥的。 酶标仪临界值计算公式的设定
成本（％）
66.29 66.29 74.76 85.59 85.59 85.59 85.59
项目
FSH LH P T PRL E2 HCG
成本（％）
66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29
项目
Ferr Foll B12 胰岛素 C-肽 自免肝 血管炎
成本（％）
严格按试剂说明书操作，加液 时看准标签，正确稀释洗涤液， 2、漏加试剂，如酶结合物、底物A、不要漏加试剂 换用合格水 盛蒸馏水的瓶子要洁净
现象
可能原因
1、底物失效、或被污染 2、加好底物后在保温时，受强光或紫 外线照射 3、反应时间过长 更换底物
解决方法
显色时避光保温 准确定时 调准水浴箱温度 加液量、稀释要准确 样品应新鲜，长期保存应-20℃， 防止污染 吸嘴应洁净 洗涤要充分
满 板 显 色
4、水浴箱温度过高 5、加酶量过多，50ul误当100ul. 丙肝酶稀释时加量过多 6、该批样品放置时间过长，样品污菌 7、吸嘴重复使用，未洗干净而用于加 酶或底物 8、洗涤不充分，反应孔中有酶残留 9、蒸馏水被污染 10、次氯酸钠污染反应板
更换蒸馏水 使用新的反应板
谢 谢
外源性标本因素：
溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP
显色。
细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作
用，并且细菌引起标本混浊。 标本4℃存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议<1周 标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成的纤维蛋白块，造成假阳性。
52.51 89.97 90.05 67.94 62.20 55.02 61.70
项目
呼吸道 过敏原 抗核抗体 抗ds-DNA 抗平滑肌抗体 ENA谱 抗线粒体抗体
成本 （％）
63.98 69.63 66.60 158.20 69.69 57.50 待定
备注
注：
此统计结果可信度为95％
一、抗原抗体反应 二、酶免疫技术的分类、原理及特点 三、酶联免疫吸附试验
6、底物作用时间不够
延长至标准时间
与酶一同加入的样品中不能用NaN3 防腐 换用合格蒸馏水或去离子水 准确配置洗涤液 夏天长途运输时，缩短时间，低温 措施 不适用失效试剂
灵 7、样品用叠氮钠防腐，抑制了酶活性 敏 8、蒸馏水被污染 度 9、洗涤液配置不当，稀释倍数>1:20 低
11、试剂盒失效
10、试剂盒运输时间太长，受高温影响
呼吸道
HIV初筛 实验室 前景 展望
迎检任务
检测方面：免疫球蛋白、补体、免疫细胞、细胞因子、免疫移植等， 技术方面：电泳技术、细胞技术、分子生物学技术、流式细胞技等 教学方面：华信临床检验技术专业
免疫室简介
工作人员 姓名 孙文鲜 刘丽娜 史可 冯凡 夜班人员 职称 主管检验技师 主管检验技师 检验师 检验员 科室骨干 职务 常规免疫 发光免疫 自身免疫 常规免疫 科室骨干 职责 免疫室组长 免疫室质控管理员 免疫室生物安全及 感染控制管理员 免疫室仪器维护 及信息管理员 科室骨干 状态 固定人员 固定人员 固定人员 固定人员 暂时固定
坚持两个原则： 1、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性 2、坚持以病人为中心，全心全心全意服务病人
免疫室简介
免疫室日常工作量（3月23日为例）
项目 普筛 标本量（人份） 项目包括内容 88 备注
门诊、病房普筛，乙肝五项（ 酶免法）
急筛复查
发光 体检 自免 杂项 总计
47
51 37 3 9 234
方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原
酶标抗原同时加入，加底物显色
应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏 度，需注意“钩状效应”
方法类型及反应原理
竞争法（测抗原）
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、
液相酶免疫测定
检测微量短肽激素、小分子抗原
酶免技术的分类 2、酶免技术特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂:
酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
3、酶免技术原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性 强、准确性好 酶标记试剂能够较 长时间保持稳定 操作简便、对环境 没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广 的新方法。
抗原抗体反应原理
氢键结合力
抗 原 抗 体 结 合 力
静电引力
范德华引力 疏水作用力
抗原抗体反应特点及影响因素
抗原抗体反应特点：1、特异性 2、比例性 3、可逆性
抗原抗体反应影响因素： 抗原抗体反应影响因素： 1 、反应物自身因素：抗原 1 、反应物自身因素： 抗体 抗原 理化性状、表位种类、数目 抗体 来源、特异性、亲和性、效价 2、反应环境条件：电解质 2、反应环境条件： 酸碱度 电解质 8·5g/LNaCl溶液 酸碱度 pH6--9为宜 温 度 温 度 最适温度为37℃
现象
可能原因
1、样品数量较多、加样时间过长
2、加样量不一致 3、孵育时间不一致
解决方法
重复测定标本时，尽可能使用 同一移液器，装紧吸嘴，条件、 人员应尽量与上次保持一致， 以排除这些因素造成的重复性 差的可能性。
重 复 性 差
4、洗涤条件不同 5、操作人员不同
满 板 白， 阳性 对照 不显 色
1、把终止液误当作酶结合物、或 底物使来自百度文库 B液 3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶 被污染，留有使酶失活的物质，
4、欢迎大家给出宝贵建议
5、坚持免疫室两个原则
免疫室简介
检验项目
普免
化学发 光 术前四项（普免） AFP 术前四项（急筛复查） CEA 体检 体检 肿瘤 性激素 HCG HAV(IgM) HEV(IgM、IgG) HBcAb 贫血三项 TAP
胰岛素 C-肽
自身免 疫
自免肝四项
ENA谱 过敏原 抗核抗体 抗线粒体抗体 血管炎
1、标本
避免溶血、 高脂血、 纤维蛋白凝块 尽量新鲜，避免细菌污染 一般5天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。
2、 试 剂
.试剂盒保存于2-8℃ .使用前应先将检测试剂
盒放置室温平衡15-30
分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。 .观察外包装和内组份有无漏液。
3、加 样
所有急筛（酶免法）
肿瘤、性激素、贫血三项、胰岛素、 C-肽、HCG AFP、CEA、乙肝五项、丙肝、普筛 自身免疫、呼吸道、过敏原、 TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、 HBcAb-IgM
免疫室简介
免疫室特殊项目检测成本
项目
AFP CEA CA153 CA199 CA125 FPSA TPSA
8、结果判读
例 ：
不同试剂盒，CUTOFF值计算方法不同
项目 CUTOFF 0.1×MIN（PCx，2.5) 阳性判断 >cut
HIV（科华）
HIV（丽珠）
0.15+MAX(NCx,0.08)
>cut
灰区又称灰色带反 应。就是把OD值在 Cut off值正负20% 这个范围内的标本 称为灰区标本。这 个范围称为灰区。
A. 加样不可太快； B. 要避免加在孔壁上部； C. 不可溅出；
D. 避免产生气泡；
E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。 加样器定期校准！
4、温 育
温育温度的选择
足够的反应时间
“边缘效应”的排除
5、洗
板
按说明书洗板次数
防止洗板机堵孔
有适当的侵泡时间
每孔加入洗液>350ul
三个必要试剂
固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
.
2、方法类型及反应原理
. 双抗体夹心法（测抗原）
方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，
加底物显色
应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定
HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等
方法类型及反应原理
双位点一步法（测抗原）
.灰区是客观存在的，没 有不存在灰区 的试剂， 我们只是尽量减少灰区 的出现比例。 .减少灰区最有效的方法 就是尽量将板洗涤干净。
五、ELISA法检测常见问题及解决方法
ELISA实验常见问题及解决方法
内源性标本因素：
类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包
被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。 补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合 而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低 异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异 嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。 溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。
测定
方法类型及反应原理 竞争法（测抗体）
原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
方法类型及反应原理
捕获法（测抗体）
应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
四、ELISA法检测注意事项
二、酶免疫技术的分类、特点及原理
1、酶免技术的分类
.
酶 免 疫 技 术
酶免疫组化
组织切片或其它标本中抗原的定位
均相
1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA
小分子激素、半抗原测定
酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
最广泛，酶联免疫吸附试验
异相
分离结合、游 离酶标记物， 底物测定
检验科 孙文鲜
3月18日免疫室差错问题分析及整改措施
3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大 吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题 ，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背 了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗 旨。 针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施： 1、端正态度、要认真、负责 2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本 标记清楚 3、增加人员缓解紧张工作状态
原理： 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应 酶对底物的显色反 应 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
二、酶联免疫吸附试验
1、基本原理
原理
.
1
包被 洗涤
反应
2
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
四、ELISA法检测注意事项 五、ELISA法检测常见问题及解决方法
一、抗原抗体反应
抗原抗体反应原理
抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化 学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体 超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。 有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。
现象
可能原因
1、试剂盒未平衡至室温
2、水浴箱温度不到37℃
解决方法
实验前试剂盒置于室温平衡30分钟 以上
调整水浴箱温度至37℃ 孵育期间不宜多开门 校准定时钟、准确定时 校准吸液器 吸嘴与移液器接合紧密 吸嘴一次性使用 瓶身应垂直滴加，保证液滴最大
显 色 淡
3、孵育时间不够 4、样品加样量偏少 5、酶结合物加样量偏少
激素等）
方法类型及反应原理
双抗原夹心法（测抗体）
原理：类似双抗体夹心法
.
操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体
方法类型及反应原理
间接法（测抗体）
方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗
人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的
不溢孔，残留<5ul 洗板后拍干，封板纸 不能重复使用
6、显
色
检查底物溶液的有效性；
试剂显色时先加A液，
后加B液，二者不要颠倒。
前后加入的间隔时间
不超过10分钟，不漏加。
A、B液应避免接触污染物。 不同厂家、批次酶显色液 不得混用
7、终止和读数
肉眼判断不准确，影响结果 酶标仪的波长选择的问题。 加完终止液后30分钟内读取数据。 保证酶标板的底部是清洁干燥的。 酶标仪临界值计算公式的设定
成本（％）
66.29 66.29 74.76 85.59 85.59 85.59 85.59
项目
FSH LH P T PRL E2 HCG
成本（％）
66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29
项目
Ferr Foll B12 胰岛素 C-肽 自免肝 血管炎
成本（％）
严格按试剂说明书操作，加液 时看准标签，正确稀释洗涤液， 2、漏加试剂，如酶结合物、底物A、不要漏加试剂 换用合格水 盛蒸馏水的瓶子要洁净
现象
可能原因
1、底物失效、或被污染 2、加好底物后在保温时，受强光或紫 外线照射 3、反应时间过长 更换底物
解决方法
显色时避光保温 准确定时 调准水浴箱温度 加液量、稀释要准确 样品应新鲜，长期保存应-20℃， 防止污染 吸嘴应洁净 洗涤要充分
满 板 显 色
4、水浴箱温度过高 5、加酶量过多，50ul误当100ul. 丙肝酶稀释时加量过多 6、该批样品放置时间过长，样品污菌 7、吸嘴重复使用，未洗干净而用于加 酶或底物 8、洗涤不充分，反应孔中有酶残留 9、蒸馏水被污染 10、次氯酸钠污染反应板
更换蒸馏水 使用新的反应板
谢 谢
外源性标本因素：
溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP
显色。
细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作
用，并且细菌引起标本混浊。 标本4℃存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议<1周 标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成的纤维蛋白块，造成假阳性。
52.51 89.97 90.05 67.94 62.20 55.02 61.70
项目
呼吸道 过敏原 抗核抗体 抗ds-DNA 抗平滑肌抗体 ENA谱 抗线粒体抗体
成本 （％）
63.98 69.63 66.60 158.20 69.69 57.50 待定
备注
注：
此统计结果可信度为95％
一、抗原抗体反应 二、酶免疫技术的分类、原理及特点 三、酶联免疫吸附试验
6、底物作用时间不够
延长至标准时间
与酶一同加入的样品中不能用NaN3 防腐 换用合格蒸馏水或去离子水 准确配置洗涤液 夏天长途运输时，缩短时间，低温 措施 不适用失效试剂
灵 7、样品用叠氮钠防腐，抑制了酶活性 敏 8、蒸馏水被污染 度 9、洗涤液配置不当，稀释倍数>1:20 低
11、试剂盒失效
10、试剂盒运输时间太长，受高温影响
呼吸道
HIV初筛 实验室 前景 展望
迎检任务
检测方面：免疫球蛋白、补体、免疫细胞、细胞因子、免疫移植等， 技术方面：电泳技术、细胞技术、分子生物学技术、流式细胞技等 教学方面：华信临床检验技术专业
免疫室简介
工作人员 姓名 孙文鲜 刘丽娜 史可 冯凡 夜班人员 职称 主管检验技师 主管检验技师 检验师 检验员 科室骨干 职务 常规免疫 发光免疫 自身免疫 常规免疫 科室骨干 职责 免疫室组长 免疫室质控管理员 免疫室生物安全及 感染控制管理员 免疫室仪器维护 及信息管理员 科室骨干 状态 固定人员 固定人员 固定人员 固定人员 暂时固定
坚持两个原则： 1、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性 2、坚持以病人为中心，全心全心全意服务病人
免疫室简介
免疫室日常工作量（3月23日为例）
项目 普筛 标本量（人份） 项目包括内容 88 备注
门诊、病房普筛，乙肝五项（ 酶免法）
急筛复查
发光 体检 自免 杂项 总计
47
51 37 3 9 234
方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原
酶标抗原同时加入，加底物显色
应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏 度，需注意“钩状效应”
方法类型及反应原理
竞争法（测抗原）
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、
液相酶免疫测定
检测微量短肽激素、小分子抗原
酶免技术的分类 2、酶免技术特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂:
酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
3、酶免技术原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性 强、准确性好 酶标记试剂能够较 长时间保持稳定 操作简便、对环境 没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广 的新方法。
抗原抗体反应原理
氢键结合力
抗 原 抗 体 结 合 力
静电引力
范德华引力 疏水作用力
抗原抗体反应特点及影响因素
抗原抗体反应特点：1、特异性 2、比例性 3、可逆性
抗原抗体反应影响因素： 抗原抗体反应影响因素： 1 、反应物自身因素：抗原 1 、反应物自身因素： 抗体 抗原 理化性状、表位种类、数目 抗体 来源、特异性、亲和性、效价 2、反应环境条件：电解质 2、反应环境条件： 酸碱度 电解质 8·5g/LNaCl溶液 酸碱度 pH6--9为宜 温 度 温 度 最适温度为37℃
现象
可能原因
1、样品数量较多、加样时间过长
2、加样量不一致 3、孵育时间不一致
解决方法
重复测定标本时，尽可能使用 同一移液器，装紧吸嘴，条件、 人员应尽量与上次保持一致， 以排除这些因素造成的重复性 差的可能性。
重 复 性 差
4、洗涤条件不同 5、操作人员不同
满 板 白， 阳性 对照 不显 色
1、把终止液误当作酶结合物、或 底物使来自百度文库 B液 3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶 被污染，留有使酶失活的物质，
4、欢迎大家给出宝贵建议
5、坚持免疫室两个原则
免疫室简介
检验项目
普免
化学发 光 术前四项（普免） AFP 术前四项（急筛复查） CEA 体检 体检 肿瘤 性激素 HCG HAV(IgM) HEV(IgM、IgG) HBcAb 贫血三项 TAP
胰岛素 C-肽
自身免 疫
自免肝四项
ENA谱 过敏原 抗核抗体 抗线粒体抗体 血管炎
1、标本
避免溶血、 高脂血、 纤维蛋白凝块 尽量新鲜，避免细菌污染 一般5天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。
2、 试 剂
.试剂盒保存于2-8℃ .使用前应先将检测试剂
盒放置室温平衡15-30
分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。 .观察外包装和内组份有无漏液。
3、加 样
所有急筛（酶免法）
肿瘤、性激素、贫血三项、胰岛素、 C-肽、HCG AFP、CEA、乙肝五项、丙肝、普筛 自身免疫、呼吸道、过敏原、 TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、 HBcAb-IgM
免疫室简介
免疫室特殊项目检测成本
项目
AFP CEA CA153 CA199 CA125 FPSA TPSA
8、结果判读
例 ：
不同试剂盒，CUTOFF值计算方法不同
项目 CUTOFF 0.1×MIN（PCx，2.5) 阳性判断 >cut
HIV（科华）
HIV（丽珠）
0.15+MAX(NCx,0.08)
>cut
灰区又称灰色带反 应。就是把OD值在 Cut off值正负20% 这个范围内的标本 称为灰区标本。这 个范围称为灰区。
A. 加样不可太快； B. 要避免加在孔壁上部； C. 不可溅出；
D. 避免产生气泡；
E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。 加样器定期校准！
4、温 育
温育温度的选择
足够的反应时间
“边缘效应”的排除
5、洗
板
按说明书洗板次数
防止洗板机堵孔
有适当的侵泡时间
每孔加入洗液>350ul
三个必要试剂
固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
.
2、方法类型及反应原理
. 双抗体夹心法（测抗原）
方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，
加底物显色
应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定
HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等
方法类型及反应原理
双位点一步法（测抗原）
.灰区是客观存在的，没 有不存在灰区 的试剂， 我们只是尽量减少灰区 的出现比例。 .减少灰区最有效的方法 就是尽量将板洗涤干净。
五、ELISA法检测常见问题及解决方法
ELISA实验常见问题及解决方法
内源性标本因素：
类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包
被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。 补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合 而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低 异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异 嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。 溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。
测定
方法类型及反应原理 竞争法（测抗体）
原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
方法类型及反应原理
捕获法（测抗体）
应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
四、ELISA法检测注意事项
二、酶免疫技术的分类、特点及原理
1、酶免技术的分类
.
酶 免 疫 技 术
酶免疫组化
组织切片或其它标本中抗原的定位
均相
1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA
小分子激素、半抗原测定
酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
最广泛，酶联免疫吸附试验
异相
分离结合、游 离酶标记物， 底物测定