酶免检测技术原理及影响分析
酶免疫测定数值-概述说明以及解释
酶免疫测定数值-概述说明以及解释1.引言1.1 概述酶免疫测定是一种通过检测酶（如辅酶或酶底物）与抗原或抗体相互作用产生的化学反应来确定物质浓度的方法。
这一技术广泛应用于医学诊断、生物学研究和农业领域等各个领域。
酶免疫测定的敏感度高，准确性好，且操作简便，逐渐成为各种实验室中常用的检测方法之一。
本文将探讨酶免疫测定的定义、原理、应用以及其优势和局限性，旨在帮助读者更深入地了解这一重要的检测技术。
1.2 文章结构本文将首先介绍酶免疫测定的概述，包括其定义、原理和应用。
然后将详细阐述酶免疫测定在医学领域的具体应用，并探讨其在诊断和治疗中的重要性。
接着，文章将分析酶免疫测定的优势和局限性，以及未来发展趋势。
最后，文章将进行结论总结，总结酶免疫测定在医学领域的意义和未来发展的前景。
通过本文的阐述，读者可以全面了解酶免疫测定的重要性和应用范围，为进一步研究和实践提供指导和参考。
1.3 目的:本文旨在深入探讨酶免疫测定在医学领域中的重要性和应用，并探讨其在疾病诊断、药物研发和治疗过程中的作用。
通过对酶免疫测定的定义、原理和应用进行详细介绍，旨在帮助读者更全面地了解该技术的优势和局限性，并展望其未来的发展趋势。
通过本文的阐述，我们希望读者对酶免疫测定有更深入的认识，加深对其在医学领域中的重要性和未来发展的认识。
2.正文2.1 酶免疫测定的定义酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）是一种通过检测生物样本中特定抗原或抗体与酶标记的结合来测定物质浓度的技术方法。
该方法利用了酶与抗原抗体结合后的高度特异性和敏感性，广泛应用于医学诊断、生物学研究以及食品安全监测等领域。
在酶免疫测定中，通常会使用一种在酶标记物质上的抗体或抗原来与待测物质中的相应抗原或抗体结合。
通过测定酶标记物质与待测物质结合的程度，可以间接反映出待测物质的浓度或数量。
这种方法具有简单、快速、灵敏度高等优点，因此被广泛应用于疾病的诊断和监测，尤其在肿瘤标志物检测和感染病原体检测方面有着重要的应用价值。
酶免疫试验的影响因素分析
三可能影响测定结果的标本因素
标本含有干扰酶免疫测定，可以出现假阳性和假阴性 结果的因素，分为两类，即内源性和外源性因素。
（一）内源性干扰因素 内源性干扰因素：一般包括类风湿因子、补体、高浓 度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、 因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反 应物质等。在日常的临床血清（浆）检测中，有相当 比例的标本不同程度含有上述各类干扰物质，导致测 定结果的假阳性。
二、患者准备及标本采集
对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注 意收集时间及体位有可能会对测定结果产生影响。
如：可的松在早晨4：00～6:00之间，会有一峰值出现； 生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵 发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在 密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值 为测定值；又如当从卧位变为立位时，血清中肾素活 性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药 代动力学选择服药后的最适时间采血检测。
需要使用其他方法如：重组免疫印迹（rerconbinant im munoblot assay，RIBA）、蛋白印迹(Western blot，WB)或中 和试验来确认，才能报告阳性。
HBsAg的测定主要是弱阳性的问题，即“灰区”，处 于cut-off值周围即“灰区”，其结果的可靠性通常较 差，阳性当然需要确认，阴性却也未必是真，这一点 在血站筛检献血员血液时非常重要，须引起注意，并 采取相应的措施，防止此类严重影响人们健康的传染 性疾病经输血传播。
1．类风湿因子(rheumatoid factors，RF)的影响
在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中，常含有 较高或不同浓度的RF，RF一般为IgM型，亦有IgG和 IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因 为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG 及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳 性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中，因 为此时固相包被的抗体为抗人μ链抗体，IgM型RF的存 在可使其大量结合于固相上。为避免RF对ELISA测定的 干扰，通常可以采取下述措施：
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
酶免疫测试EIA技术
4）加入底物ABTS和H2O2，经温育，ABTS在辣根过氧 化物酶的作用下显色，然后经波长450nm的光度计测定 获得A值，从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
（3）肿瘤标志物类：卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌、癌胚抗原、甲胎蛋 白、膀胱癌、铁蛋白等。
（4乳）素内分(PR泌L类) 、：人T3绒、T毛4、促促性卵腺泡激生素成(素HC(FGS)H、)、睾黄酮体(T生E成ST素O()L、H)孕、泌酮 ((PTSRHO)G、) 皮、质雌醇二或醇皮(E质2)酮、(雌C)三、醇促(红E3细) 、胞生生长成素素((EHPGOH))等、。促 甲 状 腺 素
（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度 差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数 量级）。
（3）根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方 法：双抗体（原）夹心法 ；间接法；竞争法
ELISA测试原理
1）将链霉亲性抗体和待测抗原加入链霉亲 合素包被小管内，经温育，生物素和亲和素发生连接， 待测抗原和特异性抗体发生结合，形成固相包被亲合素生物素-特异性抗体-待测抗原复合物，然后进行洗涤， 除去未结合的抗原和生物素标记抗体。
（1）测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温），并 检查是否已经变质，同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀 释液，若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。
（2）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。
（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。
（5）自身抗体类：ENA全套6项筛选、抗核抗体、抗Sm抗体、抗精子 抗体、抗双链/单链DNA、红斑狼疮筛选等。
全自动酶联免疫分析仪的工作原理及应用
全自动酶联免疫分析仪的工作原理及应用全自动酶联免疫分析（简称全自动酶免分析）系统的发展，可以回溯到20世纪90年代初期。
第一代全自动酶免分析系统基本技术特征是单/双针加样系统与酶标板处理系统一体化，多数孵育位置少于4块板。
由于加标本将占用较长时间（单针每板需15分钟，三块板通常需45分钟完成加标本工作），因此，第一代全自动酶免分析系统，被认为是“节约劳动力而不提高效率”。
第二代全自动酶免分析系统的基本技术特征为非多任务和单一轨道。
由于不能同时处理两种过程（如洗板的同时，不能加试剂等）。
因此，其工作任务表（或时间管理器）“堵车”现象仍无法避免，而造成处理过程不能严格执行和试验完成时间延长。
不含标本加样装置全自动酶免分析系统，通常也俗称“后处理系统”。
第三代全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道，完全实现平行过程处理。
典型产品为瑞士哈美顿公司的FAME全自动酶免分析系统。
FAME系统独特品质表现在，硬件上采用了综合模块化设计，广泛采用液体水平检测（LLD）技术、体积与重量传感、光学位置传感等实现了真正全过程控制（TPC），特别是专利的洗板液体传感，确保了最佳洗板效果。
在软件与功能上，目前仍是唯一的全自动GMP/ GLP规范符合系统，如全面的系统跟踪记录（Traceability）与系统追溯，标本/试剂加样校验（sample verification）及“自由任务管理器”实现随时增加检测板。
1997年费米获得美国FDA认证许可，用于血站筛查实验室，至今仍是唯一的特许全自动酶免分析系统。
由于酶免试验过程具有反应时间长而要求严格、步骤多而复杂。
因此，就一项具体的酶免试验而言，其试验过程与完成试验时间是不可改变和缩短的。
但对于多项目的批量处理（mass processing）时，总体的试验时间将大大缩短。
因此，酶免试验全过程自动化的意义，并非仅仅限于降低劳动强度、减少人为的误差。
根据一项多中心检测（multi-center clinical trail）的评价报告，全自动酶标分析系统可以普遍地、显著地提高酶免试验的特异性，并可提高某些检测试剂的灵敏度。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶免检测技术原理及影响
2、反应环境条件： 电解质 酸8·碱5度g/LNaCl溶液
酸碱度 pH6--9为宜
温 度 温最适度温度为37℃
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11
二、酶免疫技术的分类、特点及原理
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12
1、酶免技术的分类
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酶 免 疫 技 术
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
均相 1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA 小分子激素、半抗原测定
2加样量不一致3孵育时间不一致4洗涤条件不同5操作人员不同阳性对照不显1把终止液误当作酶结合物或底物使用严格按试剂说明书操作加液时看准标签正确稀释洗涤液不要漏加试剂2漏加试剂如酶结合物底物a3蒸馏水被污染或盛洗涤液桶被污染留有使酶失活的物质换用合格水盛蒸馏水的瓶子要洁净现象可能原因解决方法1底物失效或被污染更换底物2加好底物后在保温时受强光或紫外线照射显色时避光保温3反应时间过长准确定时4水浴箱温度过高调准水浴箱温度5加酶量过多50ul误当100ul
.灰区是客观存在的，没 有不存在灰区 的试剂， 我们只是尽量减少灰区的 出现比例。 .减少灰区最有效的方法 就是尽量将板洗涤干净。
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五、ELISA法检测常见问题及解决方法
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ELISA实验常见问题及解决方法
内源性标本因素 ：
p 类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包
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现象
可能原因
解决方法
1、试剂盒未平衡至室温 2、水浴箱温度不到37℃
实验前试剂盒置于室温平衡30分钟 以上
调整水浴箱温度至37℃ 孵育期间不宜多开门
3、孵育时间不够
显 色 4、样品加样量偏少
淡 5、酶结合物加样量偏少
酶免测定技术(精)
1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性 强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。
2. ELISA常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 酶的底物：
HRP可溶性底物及呈色：
邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)
四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)
酶免疫测定技术
概述
1 标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量 检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等） 进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后， 不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中 的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术
2 标记免疫技术的分类： ⑴按标记物分类：同位素标记
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特较好， 43℃20min可造成弱“+”假“-”
1. 使Ag(或Ab)结合到某种固相载体表面，并保持 免疫活性。 免疫吸附剂
2. 使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性， 又有酶的活性。 酶结合物
3. 标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表 面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有 色反应。 底物
二、必备试剂： 1. 固相的Ag或Ab----免疫吸附剂 2. 酶标记的Ab或Ag----结合物 3. 酶反应的底物-------底物 三、方法类型： 1. 夹心法 2. 间接法 3. 竞争法 4. 捕获法测IgM抗体
鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色：
酶免技术
酶扩大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫测定 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
毒品(如吗啡及其衍生物) +溶菌酶 ；酶底物(藤黄微球菌)。酶的活性 与待测样品中抗原的量成正比，测定酶活性以标准曲线推算出待测抗原的量。
1.抗原或抗体的固相化 ； 2.抗原或抗体的酶标记 ； 3.受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗 原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或 抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量 与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求： 纯度高、活性高
性质稳定 标记后不影响抗原或抗体的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 酶的反应产物稳定，检测简便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、价廉
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶）（无色） 亚铁血红素（辅基）（暗棕色） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
洗涤液与稀释液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐 温-20磷酸缓冲盐水（PBS,pH7.4）。
终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸。 常用的AP反应终止液为碳酸钠。
四、固相酶免疫测定仪（酶标仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速 度、震板功能、温度控制、定性和定量的软 件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
酶免试验的影响因素及处置
酶免试验的影响因素及处置目的：减少影响酶免试验结果的因素。
方法：认真总结可能遇到的因素并找出对策。
结果：大大的提升了实验室的质量管理和检测水平。
结论：使实验室的工作便于管理，使其工作的有效性得于持续。
标签：酶免试验血液检测是安全输血链条中的重要环节，确保血液检测的准确性，给临床提供安全有效的血液，杜绝经血传播疾病的发生，这是检验管理工作的重中之重.检验质量的好坏，其影响因素很多，如工作人员操作的个体差异，测量仪器与测量所用的试剂盒不同。
这给检测结果的评估带来极大的困难。
为了将这些不确定因素带来的影响控制在最小范围内，我们比较规范的开展实验室室内质控[1]工作和对工作人员的培训评估等。
1 工作人员培训评估不同的人员在操作过程中，所得到的实验结果或大或小都有差别，这就要求我们制定一系列的规则，保证差别控制在最小的范围内，如下：1.1 宣传贯彻体系文件：组织实验室工作人员认真学习体系文件，了解不同岗位的职责，掌握不同岗位的工作流程，熟记工作流程中的关键控制点。
了解检验工作的特殊性，要承担“权利、职责”与风险的双重责任。
1.2 对科室每个员工进行培训，并评估。
岗位培训内容包括：职业道德规范；检测方法及程序；法律法规；职业防护和卫生安全等。
对培训效果进行评估，对培训未达到预期要求的进行再培训。
1.3实践检验：培训都达到预期要求后进行实践检验，按照体系文件内容进行工作。
1.4加强信息管理：实验室网络信息中规定不同工作人员的权限，工作人员要在自己的工作权限范围内操作，不可越权，也不可出让自己的权限。
要知道权限与职责同在。
2仪器设备的性能与仪器设备性能有关的参数包括准确度、精密度、稳定性[2]。
通过供应商提供的参数进行多次实验，实验得出的数据必须符合要求下限。
实验室在使用新的仪器或仪器维修后，对其性能进行确认。
目的是用确认试验的结果来证实仪器具有预期的水平和达到应有的结果，从而满足实验室的要求。
使其准确度、精密度和结果的可报告范围在要求的范围之内。
免疫检测技术在酶学分析中的应用
免疫检测技术在酶学分析中的应用免疫检测技术是一种高灵敏度、高特异性的分析手段，在医学、生物学、环境监测、食品安全等领域得到广泛应用。
而酶学分析则是利用生物体所含酶的催化作用对物质进行分析测定的方法。
将免疫检测技术和酶学分析相结合，可以大大提高分析的灵敏度和特异性，为各个领域的研究和应用提供有力的技术支持。
1. ELISA法在酶学分析中的应用ELISA法是目前最常用的免疫检测技术方法之一，其原理是将待测物与标记化的抗体或抗原结合，通过比色或荧光信号等测定待测物的浓度。
在酶学分析中，ELISA法可以用于检测各种酶的活性。
以酸性磷酸酶活性测定为例。
酸性磷酸酶是一种特殊的酶，存在于各种细胞内，可作为很多疾病诊断的标志物。
使用ELISA法检测酸性磷酸酶活性，可以通过将酸性磷酸酶与特异性的抗体结合，形成酶标记复合物，再利用硫酸钼酸钠比色法或自发荧光法等方法检测酶标记物的信号，从而测定酸性磷酸酶活性的浓度。
2. 免疫酶联生物传感器的发展在ELISA法的基础上，免疫酶联生物传感器(immuno-enzyme biosensor)逐渐发展起来。
免疫酶联生物传感器是一种新型的检测手段，它将一种可测量的物理或化学信号与待测样分子之间的生物分子识别耦合起来。
其原理是将特异性的抗体或抗原与传感器表面的生物分子结合，在待测样本中存在的分子与抗体(抗原)结合后，通过光学、电化学或质谱等技术测量信号的变化，从而确定待测样分子的浓度。
免疫酶联生物传感器的优点在于其快速、灵敏和高度选择性，还可以避免传统方法中许多对环境或生物体有害的试剂和处理，具有很大的应用潜力。
近年来，随着纳米技术、生物工程和微电子技术的发展，免疫酶联生物传感器也迎来了更好的技术和应用条件。
3. 其他除了ELISA法和免疫酶联生物传感器，还有其他一些免疫检测技术也可以应用于酶学分析中。
例如，免疫电泳法是将待测物与酶标记的抗体结合后进行电泳分离，然后通过学色反应或化学荧光反应检测，可以得到待测物在电泳上的位置和数量。
EIA法
酶免疫分析（Enzyme Immunoassay,EIA）是标记免疫分析中的一项重要技术,是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一,酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新，不断和其他先进技术如荧光、发光技术以及仪器自动化相融合，日臻完善,许多自动化仪器实际上是EIA技术和其他现代化技术的复合体，其分析敏感度已达到甚至大大超过放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因试剂稳定无放射性污染且分析形式日趋多样化，简易灵活，临床应用广泛而倍受重视。
1、酶免疫分析的技术进步近年来，EIA技术取得了显著的发展，主要表现在以下方面：1.1.继单克隆抗体后的第三代抗体基因工程抗体的应用，明显地提高了检测的特异性，基本消除了抗原、抗体间的非特异性交叉反应，保证了分析的准确性。
抗体制备技术的进步，使试剂的生产制备得以规模化，检测范围日益扩展，小分子抗原、半抗原的检测成为事实。
1.2.分析方式的改进与多样化提高了试验的敏感性。
1.2.1.除早期的竞争法，间接法外，又发展了双抗原夹心法测抗体，偶联酶标记法测抗原，桥联酶免疫分析，酶放大免疫分析技术等，后者应用了生物素-亲和素系统，底物循环放大系统，酶-抗酶放大系统及酶偶联放大系统等。
1.2.2.由于酶标记技术的进步，标记酶的应用已从过氧化物酶，扩展到碱性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脱氢酶，葡萄糖氧化酶，苹果酸脱氢酶，至今有二十多种酶被应用于EIA ，但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。
1.2.3. 酶免疫分析与其它标记免疫分析相结合如与荧光免疫分析（Fluorescence Immunoassay ,FIA）结合形成荧光酶免疫分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay ，FEIA），酶促放大时间分辨荧光免疫分析（Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA与化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）结合形成酶—化学发光免疫分析，增强化学发光酶免疫分析（ECLEIA）。
酶免基本原理
（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗 原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待 测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。 待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
检测抗体的方法
（一）间接法 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为 利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有 色产物，产物的量与标本中受检物质的量直 接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性 或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可 极大地地放大反应效果，从而使测定方法达 到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体， ②酶标记的抗原或抗体， ③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性 状以及检测的具备条件，可设计出各种不同 类型的检测方法。
（2） HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固 相载体上形成固相抗体，同时加入待测标本 和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的 HBeAb和固相抗体竞争结合中和抗原HBeAg， 待测标本中HBeAb浓度越高，则与固相抗体 结合的HBeAg就越少，反之亦然；温育后洗 涤，加入酶标记的特异性抗体，酶标记抗体 与结合于固相抗体上的特异性抗原结合，温 育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待 测标本中的HBeAb含量呈反比。
基本原理
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并 保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗 体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性， 又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或 抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗 涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与其他物质分开，最后结合在固相载 体上的酶量与标本中受检物质的量成一定 的比例。
层析 酶免 化学发光
层析酶免化学发光层析酶免法（chromatographic enzyme immunoassay，CEIA）是一种常用的生物分析技术，结合了层析法和酶免法的优点，能够高灵敏度、高选择性地检测分析物。
而化学发光则是一种常用的检测方法，利用物质发光的特性进行分析。
层析酶免法是一种基于抗原与抗体结合原理的分析方法。
它首先将待检样品中的目标分析物与标记有酶的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将复合物加入到预先涂在固相材料表面的抗体上，复合物中的目标分析物会与固相上的抗体再次结合，形成多层结构。
接下来，通过洗涤步骤去除未结合的物质，然后加入底物，底物与酶发生反应产生化学发光。
根据发光的强度可以定量测定目标分析物的含量。
层析酶免法的主要优势在于其具有高灵敏度和高选择性。
层析步骤可以有效地去除干扰物质，提高了检测的灵敏度和准确性。
同时，酶免法的选择性也能够确保只有目标分析物与抗体结合，减少了假阳性的可能性。
此外，层析酶免法还可以同时检测多种目标分析物，提高了分析的效率。
化学发光是一种常用的检测方法，其原理是利用某些物质在特定条件下发光。
这种发光可以通过光学设备进行检测和测量。
化学发光的检测方法具有灵敏度高、反应速度快、信号稳定等优点。
在层析酶免法中，化学发光可以用来检测底物与酶的反应产生的发光信号，从而实现对目标分析物的定量测定。
层析酶免法结合化学发光具有广泛的应用。
在生物医学领域，层析酶免法可以用于检测血液中的生物标志物，如癌症标志物、病毒抗体等。
在环境监测中，层析酶免法可以用于检测水体、土壤中的污染物。
此外，层析酶免法还可以应用于食品安全检测、药物分析等领域。
层析酶免法结合化学发光是一种高灵敏度、高选择性的生物分析技术。
它通过层析分离和酶免原理实现对目标分析物的定量测定，同时利用化学发光进行检测。
这种方法在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用前景。
层析酶免法的发展将为生物分析领域带来更多的可能性，为人们的健康和环境保护提供更可靠的技术支持。
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成本（％）
66ห้องสมุดไป่ตู้29 66.29 74.76 85.59 85.59 85.59 85.59
项目
FSH LH P T PRL E2 HCG
成本（％）
66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29 66.29
项目
Ferr Foll B12 胰岛素 C-肽 自免肝 血管炎
成本（％）
方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原
酶标抗原同时加入，加底物显色
应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏 度，需注意“钩状效应”
方法类型及反应原理
竞争法（测抗原）
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、
酶免检测技术原理及影响因素
检验科 孙文鲜
3月18日免疫室差错问题分析及整改措施
3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大 吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题 ，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背 了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗 旨。 针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施： 1、端正态度、要认真、负责 2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本 标记清楚 3、增加人员缓解紧张工作状态
严格按试剂说明书操作，加液 时看准标签，正确稀释洗涤液， 2、漏加试剂，如酶结合物、底物A、不要漏加试剂 换用合格水 盛蒸馏水的瓶子要洁净
现象
可能原因
1、底物失效、或被污染 2、加好底物后在保温时，受强光或紫 外线照射 3、反应时间过长 更换底物
解决方法
显色时避光保温 准确定时 调准水浴箱温度 加液量、稀释要准确 样品应新鲜，长期保存应-20℃， 防止污染 吸嘴应洁净 洗涤要充分
52.51 89.97 90.05 67.94 62.20 55.02 61.70
项目
呼吸道 过敏原 抗核抗体 抗ds-DNA 抗平滑肌抗体 ENA谱 抗线粒体抗体
成本 （％）
63.98 69.63 66.60 158.20 69.69 57.50 待定
备注
注：
此统计结果可信度为95％
一、抗原抗体反应 二、酶免疫技术的分类、原理及特点 三、酶联免疫吸附试验
现象
可能原因
1、样品数量较多、加样时间过长
2、加样量不一致 3、孵育时间不一致
解决方法
重复测定标本时，尽可能使用 同一移液器，装紧吸嘴，条件、 人员应尽量与上次保持一致， 以排除这些因素造成的重复性 差的可能性。
重 复 性 差
4、洗涤条件不同 5、操作人员不同
满 板 白， 阳性 对照 不显 色
1、把终止液误当作酶结合物、或 底物使用 B液 3、蒸馏水被污染，或盛洗涤液桶 被污染，留有使酶失活的物质，
液相酶免疫测定
检测微量短肽激素、小分子抗原
酶免技术的分类 2、酶免技术特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂:
酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
3、酶免技术原理及特点
特点： 灵敏度高、特异性 强、准确性好 酶标记试剂能够较 长时间保持稳定 操作简便、对环境 没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广 的新方法。
现象
可能原因
1、试剂盒未平衡至室温
2、水浴箱温度不到37℃
解决方法
实验前试剂盒置于室温平衡30分钟 以上
调整水浴箱温度至37℃ 孵育期间不宜多开门 校准定时钟、准确定时 校准吸液器 吸嘴与移液器接合紧密 吸嘴一次性使用 瓶身应垂直滴加，保证液滴最大
显 色 淡
3、孵育时间不够 4、样品加样量偏少 5、酶结合物加样量偏少
.灰区是客观存在的，没 有不存在灰区 的试剂， 我们只是尽量减少灰区 的出现比例。 .减少灰区最有效的方法 就是尽量将板洗涤干净。
五、ELISA法检测常见问题及解决方法
ELISA实验常见问题及解决方法
内源性标本因素：
类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包
被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。 补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合 而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低 异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异 嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。 溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。
坚持两个原则： 1、坚持检验结果的准确性、及时性、有效性 2、坚持以病人为中心，全心全心全意服务病人
免疫室简介
免疫室日常工作量（3月23日为例）
项目 普筛 标本量（人份） 项目包括内容 88 备注
门诊、病房普筛，乙肝五项（ 酶免法）
急筛复查
发光 体检 自免 杂项 总计
47
51 37 3 9 234
6、底物作用时间不够
延长至标准时间
与酶一同加入的样品中不能用NaN3 防腐 换用合格蒸馏水或去离子水 准确配置洗涤液 夏天长途运输时，缩短时间，低温 措施 不适用失效试剂
灵 7、样品用叠氮钠防腐，抑制了酶活性 敏 8、蒸馏水被污染 度 9、洗涤液配置不当，稀释倍数>1:20 低
11、试剂盒失效
10、试剂盒运输时间太长，受高温影响
抗原抗体反应原理
氢键结合力
抗 原 抗 体 结 合 力
静电引力
范德华引力 疏水作用力
抗原抗体反应特点及影响因素
抗原抗体反应特点：1、特异性 2、比例性 3、可逆性
抗原抗体反应影响因素： 抗原抗体反应影响因素： 1 、反应物自身因素：抗原 1 、反应物自身因素： 抗体 抗原 理化性状、表位种类、数目 抗体 来源、特异性、亲和性、效价 2、反应环境条件：电解质 2、反应环境条件： 酸碱度 电解质 8·5g/LNaCl溶液 酸碱度 pH6--9为宜 温 度 温 度 最适温度为37℃
呼吸道
HIV初筛 实验室 前景 展望
迎检任务
检测方面：免疫球蛋白、补体、免疫细胞、细胞因子、免疫移植等， 技术方面：电泳技术、细胞技术、分子生物学技术、流式细胞技等 教学方面：华信临床检验技术专业
免疫室简介
工作人员 姓名 孙文鲜 刘丽娜 史可 冯凡 夜班人员 职称 主管检验技师 主管检验技师 检验师 检验员 科室骨干 职务 常规免疫 发光免疫 自身免疫 常规免疫 科室骨干 职责 免疫室组长 免疫室质控管理员 免疫室生物安全及 感染控制管理员 免疫室仪器维护 及信息管理员 科室骨干 状态 固定人员 固定人员 固定人员 固定人员 暂时固定
满 板 显 色
4、水浴箱温度过高 5、加酶量过多，50ul误当100ul. 丙肝酶稀释时加量过多 6、该批样品放置时间过长，样品污菌 7、吸嘴重复使用，未洗干净而用于加 酶或底物 8、洗涤不充分，反应孔中有酶残留 9、蒸馏水被污染 10、次氯酸钠污染反应板
更换蒸馏水 使用新的反应板
谢 谢
4、欢迎大家给出宝贵建议
5、坚持免疫室两个原则
免疫室简介
检验项目
普免
化学发 光 术前四项（普免） AFP 术前四项（急筛复查） CEA 体检 体检 肿瘤 性激素 HCG HAV(IgM) HEV(IgM、IgG) HBcAb 贫血三项 TAP
胰岛素 C-肽
自身免 疫
自免肝四项
ENA谱 过敏原 抗核抗体 抗线粒体抗体 血管炎
原理： 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应 酶对底物的显色反 应 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
二、酶联免疫吸附试验
1、基本原理
原理
.
1
包被 洗涤
反应
2
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
3
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
四、ELISA法检测注意事项 五、ELISA法检测常见问题及解决方法
一、抗原抗体反应
抗原抗体反应原理
抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化 学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体 超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。 有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。
测定
方法类型及反应原理 竞争法（测抗体）
原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
方法类型及反应原理
捕获法（测抗体）
应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
四、ELISA法检测注意事项
二、酶免疫技术的分类、特点及原理
1、酶免技术的分类
.
酶 免 疫 技 术
酶免疫组化
组织切片或其它标本中抗原的定位
均相
1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA
小分子激素、半抗原测定
酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
最广泛，酶联免疫吸附试验
异相
分离结合、游 离酶标记物， 底物测定
8、结果判读
例 ：
不同试剂盒，CUTOFF值计算方法不同
项目 CUTOFF 0.1×MIN（PCx，2.5) 阳性判断 >cut
HIV（科华）
HIV（丽珠）
0.15+MAX(NCx,0.08)